Parafibromin在結(jié)直腸癌中的表達及其機制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是世界上最常見的癌癥之一,全世界每年的新發(fā)結(jié)直腸癌病例占所有新發(fā)癌癥病例的10％。雖然在病理學和遺傳學方面研究表明結(jié)腸腺瘤先發(fā)于大多數(shù)腺癌,但我們對結(jié)直腸癌發(fā)生和不良預后的分子機制了解甚少。
　　Parafibromin是由HRPT2基因編碼的腫瘤抑制因子,在甲狀旁腺癌、乳腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌中,均發(fā)現(xiàn)parafibromin表達下調(diào),并與腫瘤惡性病理生物學行為關(guān)系密切。Parafibromin蛋白可與剪切多聚腺苷酸特異性

2、因子(cleavage and polyadenylation specificity factor,CPSF)、剪切刺激因子(leavage stimulation factor,CStF)及偶對蛋白(symplekin)形成復合物,還可以與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)和多聚腺苷化元件結(jié)合蛋白1(CPEB1)相互作用,這些復合體可結(jié)合于核酸序列后調(diào)節(jié)啟動子活性或mRNA成熟,進而參與細胞周期、細胞增殖、凋亡、分化、遷徙和轉(zhuǎn)移等生物學活動

3、。
　　第一部分結(jié)直腸癌組織中parafibromin的表達及其臨床病理意義
　　目的:
　　研究parafibromin在結(jié)直腸癌組織中的定位和表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性,以初步探討parafibromin在結(jié)直腸癌中表達的臨床病理意義。
　　方法:
　　1.采用 RT-PCR方法檢測15例冰凍結(jié)直腸癌及癌旁組織中的parafibromin mRNA的表達;
　　2.采用Western蛋白印跡方

4、法檢測15例冰凍結(jié)直腸癌及癌旁組織中的parafibromin蛋白的表達;
　　3.構(gòu)建組織芯片,利用免疫組織化學SP方法檢測結(jié)直腸癌(n=306)及癌旁組織（n=279)中 parafibromin蛋白表達,分析結(jié)直腸癌組織中parafibromin蛋白表達的臨床病理意義。
　　4.所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,Spearman秩相關(guān)系數(shù)檢驗分析parafibromin表達與臨床病理資料關(guān)系。Kaplan-M

5、eier法建立生存曲線,Cox比例風險回歸分析建立多因素生存分析數(shù)據(jù)的比例危險模型。P<0.05視為具有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)果:
　　1.結(jié)直腸癌冰凍組織標本中的parafibromin mRNA及蛋白的表達
　　15例結(jié)直腸癌及癌旁組織樣本中,各有4例mRNA未出現(xiàn)目的條帶,parafibromin mRNA表達的陽性率各為73.3%(11/15)。統(tǒng)計分析顯示,結(jié)直腸癌組織中的parafibromin mRNA表達

6、水平與癌旁組織無明顯差異(P>0.05)。15例癌旁組織樣本中,有2例蛋白樣品未出現(xiàn)目的條帶;15例結(jié)直腸癌組織樣本均有 parafibromin表達,結(jié)直腸癌組織中的parafibromin蛋白表達水平與癌旁組織無明顯差異(P>0.05)。
　　2.結(jié)直腸癌組織中parafibromin蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　應用免疫組化方法檢測parafibromin蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達情況,結(jié)果顯示 paraf

7、ibromin蛋白表達于細胞核。Parafibromin蛋白在癌和癌旁組織中陽性表達率分別為53.9%(165/306)和91.4%(255/279)。統(tǒng)計學分析顯示,在結(jié)直腸癌組織中parafibromin蛋白表達低于癌旁正常粘膜（P﹤0.05)。Parafibromin蛋白表達與患者性別（P=0.292)、年齡(P=0.758)及靜脈侵襲(P=0.173)因素無關(guān),parafibromin蛋白表達與腫瘤直徑(P=0.019)、UIC

8、C分期(P=0.017)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)呈負相關(guān)。Kaplan-Meier法建立生存曲線,顯示parafibromin蛋白表達陽性患者累積生存率明顯高于陰性患者(P﹤0.05)。COX比例風險回歸分析表明parafibromin蛋白表達是結(jié)直腸癌患者獨立的預后因素(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.結(jié)直腸癌組織中 parafibromin mRNA和蛋白表達水平與癌旁正常黏膜組織無明顯差異。
　　2.

9、臨床病理分析結(jié)果顯示 parafibromin在結(jié)直腸癌中的表達降低可能參與結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移。
　　3.Parafibromin表達降低可能影響結(jié)直腸癌患者的生存時間,可以作為評估預后的有效生物學標志物。
　　第二部分parafibromin重組載體轉(zhuǎn)染細胞的生物學效應及其機制研究
　　目的:
　　研究外源基因parafibromin對結(jié)腸癌細胞株DLD-1的影響及其可能機理。
　　方法:
　　1

10、.選取結(jié)腸癌細胞株DLD-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染parafibromin真核表達質(zhì)粒,通過western和RT-PCR檢測單克隆中parafibromin的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,挑選出穩(wěn)定高表達parafibromin蛋白的單克隆細胞株;
　　2.采用PI染色檢測轉(zhuǎn)染前后細胞周期改變,ALP活性檢測轉(zhuǎn)染前后細胞分化情況,劃痕修復實驗及Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細胞侵襲和轉(zhuǎn)移水平,通過這一系列的實驗來研究轉(zhuǎn)染后細胞的生物行為學改變;
　

11、　3.采用qRT-PCR方法檢測周期和凋亡因子的mRNA表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 parafibromin真核表達質(zhì)粒后,檢測單克隆細胞株parafibromin mRNA和蛋白表達
　　我們選取結(jié)腸癌細胞株DLD-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染parafibromin的真核表達重組載體,挑選出3種單克隆細胞株檢測mRNA和蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)僅有1號克隆的mRNA和蛋白表達水平明顯高于未轉(zhuǎn)染細胞株,達到未轉(zhuǎn)染細胞株的兩倍以上

12、,差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05),而其它單克隆細胞株未見明顯改變(P>0.05)。
　　2.Parafibromin轉(zhuǎn)染前后,DLD-1的生物行為學改變
　　Parafibromin轉(zhuǎn)染后,細胞各周期所占比例為G1(53.5%),S(30.5%)和G2(16.0%);未轉(zhuǎn)染細胞各周期所占比例為G1(48.5%),S(26.5%)和G2(25.0%),轉(zhuǎn)染后G1和S期所占細胞比例明顯升高,而G2期所占細胞比例顯著下降,差異有

13、統(tǒng)計學意義(P﹤0.05);Parafibromin轉(zhuǎn)染后,細胞的ALP活性為12pg/ug,未轉(zhuǎn)染細胞的ALP活性為6.5pg/ug,轉(zhuǎn)染后細胞的堿性磷酸酶活性顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05);parafibromin轉(zhuǎn)染后的細胞,Transwell試驗中未見侵襲,未轉(zhuǎn)染細胞也未見侵襲,兩者未見明顯差異(P>0.05);細胞劃痕實驗中,parafibromin轉(zhuǎn)染細胞12h遷移68.9um,24h遷移118.9um,未轉(zhuǎn)染細

14、胞12h遷移58.9um,24h遷移124.6um,兩者未見明顯差異(P>0.05)。
　　3.Parafibromin轉(zhuǎn)染前后,周期和凋亡因子mRNA的表達水平
　　Parafibromin轉(zhuǎn)染細胞中,c-myc、cyclinD1、cdc2、AKT1、AKT2及Bad mRNA表達降低,parafibromin、cyclinB1 mRNA表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后,p21、p27、cyclinE1、

15、AKT3、Bax、β-catenin mRNA未見明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.DLD-1細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染parafibromin重組載體后,parafibromin mRNA和蛋白表達升高。
　　2.轉(zhuǎn)染parafibromin后,DLD-1出現(xiàn)細胞周期阻滯,parafibromin促進DLD-1細胞分化,但不抑制細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　3.轉(zhuǎn)染parafibromin后,細胞周期蛋白mRNA表達降