NDRG2基因在結(jié)直腸癌中的表達、功能和作用機制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)在世界范圍內(nèi)是最常見的惡性腫瘤之一。目前對CRC的主要治療手段是通過外科手術(shù)切除原發(fā)腫瘤，并且輔以新輔助化療、輔助化療和放射治療。盡管近年來醫(yī)學界在CRC的早期診斷、根治術(shù)式、放射治療和輔助化療方面取得了一定的進展，但CRC的發(fā)病率和死亡率在近二十年來仍呈逐年上升的趨勢，而且TNM分期Ⅲ期和IV期的CRC病例的術(shù)后五年生存率仍較低。在CRC導致死亡的病例中，腫瘤進展導致的侵襲轉(zhuǎn)移和術(shù)

2、后復發(fā)是致死的主要原因。因此，明確CRC發(fā)生發(fā)展的分子機制對CRC的預后診斷、個體化治療以及靶向治療具有重要的理論和實際意義。N-myc downstream-regulated gene（NDRG）家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四個具備57％-65％氨基酸同源性的成員組成。其中的NDRG2基因是由我校生物化學與分子生物學教研室首先克隆得到并報道的新基因。前期的研究發(fā)現(xiàn)NDRG2作為癌基因Myc的下游調(diào)節(jié)基因，在多

3、種人類惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中呈低表達，說明該基因極其有可能作為一個重要的抑癌基因參與腫瘤惡性生物學行為的調(diào)節(jié)。但是NDRG2在CRC中的表達模式、具體的細胞水平和分子水平功能以及相關(guān)的作用機制迄今為止仍未闡明。
　　本研究為了闡明以上問題：
　　1．首先利用RT-PCR初步檢測了30例隨機選取的臨床CRC組織和配對正常組織中的NDRG2mRNA表達水平。
　　2．使用R

4、ealtime PCR檢測了226例臨床CRC組織和配對正常組織中的NDRG2mRNA表達水平，并使用統(tǒng)計學方法分析NDRG2mRNA表達與臨床病理資料以及病例預后的關(guān)系。
　　3．使用western blot檢測了86例隨機選取的臨床CRC組織和配對正常組織中的NDRG2蛋白表達水平。
　　4．使用西京醫(yī)院收集的260例臨床CRC標本和天津市人民醫(yī)院收集的681例臨床CRC標本制成組織芯片，并收集詳細的臨床病理資料和預后隨

5、訪資料。對組織芯片進行NDRG2免疫組織化學染色和結(jié)果判讀，使用統(tǒng)計學方法分析大樣本中NDRG2蛋白表達與臨床病理資料和病例預后的關(guān)系。
　　5．使用脂質(zhì)體分別將pcDNA3.1-NDRG2和siRNA-NDRG2轉(zhuǎn)染入SW620細胞內(nèi)，使用Realtime PCR鑒定NDRG2mRNA水平的表達改變，使用western blot檢測NDRG2蛋白水平的表達改變。將實驗細胞分為pcDNA3.1-NDRG2組、siRNA-NDRG2

6、組、空白對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SW620細胞）和空載體對照組（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的SW620細胞）。使用MTT比色法和軟瓊脂克隆形成實驗檢測SW620細胞的生長情況，使用流式細胞儀分析細胞的周期和凋亡，使用transwell實驗檢測細胞的侵襲能力，使用裸鼠移植瘤實驗觀察細胞的體內(nèi)成瘤能力。
　　6．使用免疫組織化學染色方法分析CRC組織芯片中NF-κB通路主要信號分子p65的表達情況，并使用統(tǒng)計學方法分析臨床標本中NDR

7、G2與p65表達之間的關(guān)系。使用Realtime PCR和western blot方法檢測SW620細胞分別染入pcDNA3.1-NDRG2、siRNA-NDRG2后p65的表達情況。
　　以上的研究發(fā)現(xiàn)：
　　1．在使用RT-PCR檢測的30例臨床CRC組織和配對正常組織中，有12例CRC的NDRG2mRNA表達量較配對正常組織相比降低50％以上，說明NDRG2mRNA表達水平在CRC中有降低的趨勢。
　　2．使用R

8、ealtimePCR檢測的所有226例臨床CRC組織和配對正常組織中，統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)NDRG2mRNA的表達水平在CRC組織中明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。而且NDRG2mRNA的表達水平與CRC的分化程度（P＜0.001）以及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.001）。
　　3．在使用western blot檢測的86例臨床CRC組織和配對正常組織中，有52例CRC的NDRG2蛋白表達水平明顯低于配對正常組織，趨勢與

9、mRNA水平檢測結(jié)果一致。
　　4．在使用免疫組織化學染色方法檢測的組織芯片中，統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)CRC標本中的NDRG2蛋白表達水平與配對正常組織相比明顯降低（P＜0.001）。而且NDRG2蛋白表達水平與CRC的分化程度（P＜0.001）以及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.001）。單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)NDRG2蛋白表達水平可以作為CRC的獨立預后影響因素。
　　5．Realtime PCR和western blot證實了

10、將pcDNA3.1-NDRG2和siRNA-NDRG2轉(zhuǎn)染入SW620細胞后，NDRG2mRNA和蛋白水平會分別升高和降低。MTT實驗發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細胞生長明顯加快而pcDNA3.1-NDRG2組細胞生長則受到明顯抑制。軟瓊脂克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細胞克隆形成數(shù)量明顯增加而pcDNA3.1-NDRG2組細胞克隆形成數(shù)量則明顯減少。流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-NDRG2組

11、細胞發(fā)生了明顯的G1期阻滯。流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細胞凋亡明顯減少而pcDNA3.1-NDRG2組細胞凋亡則明顯增加。transwell實驗檢測細胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細胞侵襲能力明顯增強而pcDNA3.1-NDRG2組細胞侵襲能力則明顯減弱。裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細胞體內(nèi)成瘤能力明顯增強而pcDNA3.1-NDRG2組細胞體內(nèi)成瘤能力明顯下

12、降。
　　6．免疫組織化學染色方法分析CRC組織芯片中NDRG2和NF-κB通路主要信號分子p65的表達情況發(fā)現(xiàn)NDRG2與p65的蛋白表達水平在臨床CRC標本中呈負相關(guān)。RealtimePCR和westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)SW620細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NDRG2后p65的表達水平降低，而轉(zhuǎn)入siRNA-NDRG2后SW620細胞中p65的表達則上升。
　　以上的研究結(jié)果證明NDRG2的表達水平在CRC中呈下調(diào)表