2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是目前常見的胃腸道惡性腫瘤,尋找有效靶點抑制CRC進展仍面臨巨大挑戰(zhàn)。
  腫瘤進展是腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境相互作用、相互促進的過程,腫瘤血管生成和間質(zhì)成纖維細胞活化是腫瘤微環(huán)境中重要的促腫瘤因素。
  顆粒蛋白前體(Progranulin,PGRN)基因位于人17號染色體,編碼區(qū)由12個外顯子(Ⅰ-Ⅻ)構(gòu)成。廣泛表達于免疫細胞、神經(jīng)元、上皮細胞及軟骨細胞等,在介導創(chuàng)傷愈

2、合、抑制神經(jīng)退行性變及軟骨形成方面發(fā)揮了重要作用。
  腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor2,TNFR2)是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員,分為可溶型(sTNFR2)和膜結(jié)合型(mTNFR2),在多種腫瘤中高表達,并參與了腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。
  研究目的:
  明確PGRN與CRC患者臨床參數(shù)和預后的相關(guān)性;檢測PGRN對CRC增殖和血管生成的作用;檢測C

3、RC中PGRN對間質(zhì)成纖維細胞活化的作用;明確PGRN發(fā)揮以上作用的分子機制;明確TNFR2與CRC患者臨床參數(shù)和預后的相關(guān)性,并進一步研究PGRN對TNFR2表達的調(diào)節(jié)作用,以期為CRC的治療提供新的靶點。
  研究方法:
  1.免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)檢測PGRN在CRC組織和正常結(jié)直腸組織中的表達,并進一步分析CRC組織中PGRN表達與患者臨床參數(shù)及預后的關(guān)系;RT-PCR、W

4、estern blot、ELISA檢測PGRN在人CRC細胞系和人正常腸上皮細胞系中的表達。
  2.用p-GPU6/GFP/Neo/PGRN質(zhì)?;蚩蛰d體轉(zhuǎn)染CRC細胞SW480、SW1116和HT29,獲得干擾PGRN表達的CRC細胞株SW480-PGRN-sh、SW1116-PGRN-sh、HT29-PGRN-sh及對照細胞株SW480-NC-sh、SW1116-NC-sh、HT29-NC-sh;用pEZ-M61/GFP/PG

5、RN質(zhì)?;蚩蛰d體轉(zhuǎn)染CRC細胞SW480、SW1116,獲得過表達PGRN的細胞株SW480-PGRN-vector、SW1116-PGRN-vector及對照細胞株SW480-NC-vector、SW1116-NC-vector。RT-PCR、Western blot確定轉(zhuǎn)染效率。
  3.IHC檢測增殖指標Ki67在CRC組織的表達,并分析與PGRN的相關(guān)性;上調(diào)/下調(diào)SW1116細胞PGRN表達后,RT-PCR、Wester

6、n blot檢測Ki67、抗凋亡指標Bcl-2表達變化;MTT檢測細胞生長變化;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化。下調(diào)HT29細胞PGRN表達后,MTT檢測細胞生長變化。檢測PGRN重組蛋白對SW1116細胞Ki67表達的影響。
  4.IHC檢測VEGF-A、血管內(nèi)皮細胞標記分子CD34在CRC中的表達,并分析PGRN與VEGF-A表達和微血管密度(MVD)的相關(guān)性;上/下調(diào)SW1116細胞PGRN表達后,檢測VEGF-A、成纖維細胞

7、生長因子1(FGF1)、VEGF-C表達的變化;檢測PGRN重組蛋白對SW1116細胞VEGF-A表達的影響;檢測SW1116-PGRN-vector細胞條件培養(yǎng)基或PGRN重組蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)Ki67、VEGF-A表達及增殖、遷移、成管能力的影響。
  5.Western blot檢測PGRN對SW1116細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal regulated kinases,ER

8、K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB or AKT)、P38磷酸化水平的影響,并篩選出PGRN下游通路靶點ERK、AKT;加入ERK或AKT通路阻滯劑后,檢測PGRN誘導的Ki67、VEGF-A表達的變化,以明確PGRN是否通過ERK、AKT通路調(diào)節(jié)Ki67、VEGF-A的表達;加入TNFR2中和抗體,檢測PGRN誘導的SW1116細胞中Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT的變化,以明確TNFR2在PGR

9、N對CRC細胞Ki67、VEGF-A表達調(diào)節(jié)中的作用。加入TNFR2中和抗體,檢測SW1116-PGRN-vector細胞條件培養(yǎng)基或PGRN重組蛋白誘導的HUVEC細胞Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT表達的變化,以明確TNFR2在PGRN誘導HUVEC細胞血管形成能力中的作用。
  6.將CRC細胞SW480、SW1116與結(jié)腸間質(zhì)成纖維細胞CCD-18Co同時均勻鋪種于六孔板中,設(shè)固定時間點觀察細胞貼壁情況,比較

10、貼壁時間的差異;將SW480或SW1116細胞與CCD-18Co細胞共培養(yǎng),根據(jù)貼壁時間的差異分離獲得成纖維細胞,分別命名為CCD-18Co/SW480細胞或CCD-18Co/SW1116細胞,通過檢測上皮標記E-cadherin和成纖維細胞活化標記α-SMA的表達驗證分離后成纖維細胞的純度。
  7.IHC染色并分析CRC細胞中PGRN表達與間質(zhì)中α-SMA表達的相關(guān)性;將SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh分別與

11、CCD-18Co細胞共培養(yǎng),分離后檢測CCD-18Co、CCD-18Co/SW480-NC-sh及CCD-18Co/SW480-PGRN-sh細胞中Ki67、FAP、α-SMA的表達差異;MTT檢測增殖能力變化;Transwell小室檢測遷移能力變化;凝膠收縮實驗檢測收縮能力變化。同樣方法檢測SW1116細胞中PGRN變化對共培養(yǎng)的成纖維細胞中Ki67、FAP、α-SMA表達的影響。PGRN重組蛋白處理CCD-18Co細胞,進一步觀察P

12、GRN對成纖維細胞增殖能力、遷移能力、收縮能力的影響。
  8.分別與SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh細胞共培養(yǎng)后,檢測CCD-18Co、CC D-18CO/SW480-NC-sh、CCD-18CO/SW480-PGRN-sh細胞中ERK、AKT、P38、JNK磷酸化水平的差異;PGRN重組蛋白處理后,檢測CCD-18Co細胞ERK、AKT、P38、JNK磷酸化水平變化,篩選出PGRN下游通路靶點ERK、AKT;

13、加入ERK或AKT通路阻滯劑,檢測PGRN重組蛋白誘導的CCD-18Co細胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達變化,明確PGRN是否通過ERK、AKT通路調(diào)節(jié)成纖維細胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達變化。加入TNFR2中和抗體后,檢測PGRN重組蛋白誘導的CC D-18Co細胞中Ki67、FAP、α-SMA、p-ERK、p-AKT表達及細胞增殖、遷移、收縮能力的變化。
  9.IHC檢測CRC組織中TNFR2的表達,分析其

14、與CRC患者臨床參數(shù)及預后的相關(guān)性,并分析與PGRN表達的相關(guān)性;通過轉(zhuǎn)染上調(diào)/下調(diào)SW480細胞、SW1116細胞PGRN的表達,檢測TNFR2表達的變化;用PGRN重組蛋白處理SW480細胞、SW1116細胞,檢測TNFR2表達的變化;上調(diào)PGRN表達或PGRN重組蛋白處理后,檢測SW480細胞、SW1116細胞p-ERK、p-AKT、p-P38的變化;加入ERK阻滯劑U0126或AKT阻滯劑LY294002后,檢測SW480細胞、

15、SW1116細胞TNFR2表達的變化。
  研究結(jié)果:
  1.PGRN在CRC中高表達,并與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預后密切相關(guān)
  2.PGRN促進了CRC增殖
  4.PGRN通過TNFR2/AKT和ERK通路促進了CRC細胞Ki67、VEGF-A的表達和HUVEC的血管形成能力
  5.共培養(yǎng)后成纖維細胞分離及純度鑒定
  鏡下觀察發(fā)現(xiàn):CCD-18Co細胞在30分鐘時已貼壁,SW480

16、、SW1116細胞在90分鐘時才開始貼壁,貼壁時間差異明顯;與SW480細胞共培養(yǎng),分離后得到成纖維細胞CCD-18Co/SW480并進行純度驗證:免疫細胞化學(ICC)檢測發(fā)現(xiàn)上皮標記分子E-cadherin在SW480細胞上染色明顯,而CCD-18Co/SW480細胞成纖維細胞活化標記分子α-SMA染色明顯,未見E-cadherin顯色;Western blot檢測同樣發(fā)現(xiàn)SW480細胞E-cadherin表達明顯,未檢測到α-SM

17、A表達,而CCD-18CO/SW480細胞α-SMA表達明顯,未檢測到E-cadherin表達。
  6.CRC細胞來源的PGRN促進了成纖維細胞的增殖、遷移、收縮能力
  7.TNFR2/AKT和ERK信號通路參與了PGRN對成纖維細胞活化的調(diào)節(jié)
  8.TNFR2在CRC中高表達,并與患者年齡、腫瘤大小及不良預后密切相關(guān)
  9.PGRN通過AKT信號通路促進CRC細胞TNFR2的表達
  研究結(jié)論:<

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