TIMP1在結(jié)直腸癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:腫瘤是人類健康的最大危害因素之一，隨著世界人口的增長(zhǎng)和老齡化的加劇，全球癌癥負(fù)擔(dān)持續(xù)增加。據(jù)GLOBOCAN估計(jì)，2008年大約有1270萬(wàn)新發(fā)癌癥病例和760萬(wàn)死亡病例。結(jié)直腸癌作為男性中第三大常見(jiàn)的腫瘤，女性中第二常見(jiàn)的腫瘤，在過(guò)去的幾年里，伴隨外科手術(shù)、放化療、分子靶向生物治療的進(jìn)步和疾病的早期檢測(cè)，結(jié)直腸癌的生存預(yù)后得到了顯著提高。但結(jié)直腸癌患者的長(zhǎng)期預(yù)后仍然令人失望，特別是晚期大腸癌的5年總生存率只有19％或更

2、低。
　　 已證實(shí)結(jié)直腸癌的發(fā)生與諸多癌基因和抑癌基因及其產(chǎn)物的表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)，從細(xì)胞分子水平深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，特別是從基因水平上研究尋找結(jié)直腸癌相關(guān)基因，對(duì)結(jié)直腸癌的診斷、治療和預(yù)防發(fā)揮著重要的作用。因此，首先利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了4例結(jié)直腸腺癌原發(fā)腫瘤組織和配對(duì)的4例腹膜轉(zhuǎn)移組織全基因組mRNA表達(dá)水平的差異，通過(guò)與原發(fā)腫瘤組織的比較，篩選出表達(dá)差異顯著的候選基因。鑒于文獻(xiàn)學(xué)習(xí)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終把注意力

3、集中在了基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP1)基因。接著，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了112例結(jié)直腸癌組織中TIMP1蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIMP1蛋白在結(jié)直腸癌組織中亦高表達(dá)。于是探討了TIMP1的表達(dá)水平與大腸癌標(biāo)本的臨床病理資料、患者生存期的關(guān)聯(lián)性。為進(jìn)一步驗(yàn)證TIMP1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，應(yīng)用MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、克隆形成、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了TIMP1基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、腫瘤球形成能力、細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力

4、和大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU藥物敏感性的影響。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)作為導(dǎo)致癌癥患者最常見(jiàn)的死亡原因，因此深入探討了TIMP1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及對(duì)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平的影響。此外，通過(guò)Targetscan，miRanda和PicTar4三個(gè)miRNA生物信息分析網(wǎng)站，預(yù)測(cè)了靶向調(diào)控TIMP1表達(dá)的潛在miRNAs，三種預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示miR-618同TIMP1的3'UTR存在互補(bǔ)的堿基序列結(jié)合位點(diǎn)。于是應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基

5、因和Western blot等分子生物學(xué)方法，進(jìn)一步研究了miR-618對(duì)TIMP1表達(dá)水平的調(diào)控及機(jī)制。原位雜交和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)分析miR-618和TIMP1在結(jié)直腸癌組織表達(dá)量及其相互關(guān)聯(lián)性。通過(guò)上述研究，讓我們深入了解了TIMP1在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的致癌作用及其涉及的分子調(diào)控機(jī)制，為早期診斷、治療和預(yù)防結(jié)直腸癌提供了新的策略和理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一章選取結(jié)直腸癌伴腹膜種植轉(zhuǎn)移病人4例，提

6、取原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉(zhuǎn)移組織RNA，高通量基因芯片技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜分析;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TIMP1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)模式，并評(píng)價(jià)TIMP1表達(dá)水平與標(biāo)本的臨床病理資料的關(guān)聯(lián)性，分析其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存期預(yù)后的關(guān)系。
　　 第二章鑒于TIMP1與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者生存期具有顯著相關(guān)性，本課題進(jìn)一步深入研究了TIMP1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。首先，針對(duì)TIMP1基因的開(kāi)放讀碼框

7、序列設(shè)計(jì)了si-RNA。轉(zhuǎn)染si-RNA至SW-620細(xì)胞中，采用Western blot和免疫熒光評(píng)估si-RNA干擾TIMP1基因表達(dá)的效率。接著，通過(guò)MTT生長(zhǎng)曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)、重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TIMP1表達(dá)水平的變化對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、腫瘤球形成及細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。同時(shí)MTT法檢測(cè)了si-TIMP-1-SW-620細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥性的影響。
　　 第三章針對(duì)TIMP1能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞

8、轉(zhuǎn)移侵襲的特征，利用RT-PCR和Western blot檢測(cè)了si-RNA對(duì)MT1-MMP表達(dá)水平的作用。同時(shí)為了驗(yàn)證TIMP1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，我們應(yīng)用Western blot測(cè)定了TIMP1的表達(dá)下調(diào)對(duì)上皮標(biāo)記物E-cadherin和間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin表達(dá)量的影響。為進(jìn)一步明確引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制，Western blot檢測(cè)了與EMT相關(guān)的標(biāo)記物ZEB1、ZEB2和Sail1。
　　

9、第四章應(yīng)用Targetscan、miRanda和PicTar4三個(gè)生物信息分析網(wǎng)站，預(yù)測(cè)了可能調(diào)控人源TIMP1表達(dá)的潛在miRNAs。三個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示miR-618同TIMP13'UTR有結(jié)合位點(diǎn)。將miR-618轉(zhuǎn)染至SW-620細(xì)胞，QRT-PCR檢測(cè)miR-618在miR-618/SW-620和NC/SW-620兩處理組細(xì)胞中的表達(dá)水平。同時(shí)將miR-618轉(zhuǎn)染至SW-620細(xì)胞，Western blot和免疫熒光檢測(cè)mi

10、R-618/SW-620和NC/SW-620兩組細(xì)胞的TIMP1蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建含有TIMP1編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的雙熒光報(bào)告基因載體(pTIMP1-CDS)，測(cè)序驗(yàn)證插入片段的序列正確與否。將pTIMP1-CDS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW-620和293T細(xì)胞并分別經(jīng)miR-618模擬物或抑制物處理，應(yīng)用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)經(jīng)不同處理后的細(xì)胞的熒光素變化。應(yīng)用原位雜交、免疫組織化學(xué)方法和QRT-PCR分別檢測(cè)38例結(jié)直腸癌組織中TIMP-1和miR-6

11、18表達(dá)，并對(duì)結(jié)直腸癌組織中miR-618和TIMP-1表達(dá)水平相關(guān)性作分析。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。TIMP1的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)分析;生存分析采用Kaplan-Meier法，log-rank檢驗(yàn)比較生存差異。腫瘤球數(shù)量的比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。臨床樣本中miR-618和TIMP1關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)分析。P＜0.0

12、5被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 第一章利用高通量基因芯片技術(shù)對(duì)原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉(zhuǎn)移組織樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腹膜轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)上調(diào)大于4倍的基因有24個(gè)，其中TIMP1基因在腹膜轉(zhuǎn)移組織中明顯高于原發(fā)腫瘤組織，高4.49倍。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)112例結(jié)直腸癌組織中TIMP1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示TIMP1在癌細(xì)胞漿中表達(dá)，陰性表達(dá)10例(8.9％)，低表達(dá)26例(23.2％)，中度表達(dá)42例(

13、37.5％)，強(qiáng)表達(dá)34例(30.4％)。通過(guò)免疫組化結(jié)果結(jié)合臨床資料，分別分析了腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期與TIMP1表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TIMP1表達(dá)高低與腫瘤大小(P=0.000)、淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.001)、臨床分期(P=0.004)具有顯著相關(guān)性。通過(guò)Kaplan-Meier法分析了TIMP1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系，112例結(jié)直腸癌患者全部接受了隨訪，結(jié)果顯示，TIMP1的表達(dá)越高，中位生存時(shí)間越短;相反，表達(dá)越低，

14、中位生存時(shí)間越長(zhǎng)。
　　 第二章 siRNA-TIMP1小分子轉(zhuǎn)染SW-620細(xì)胞，Western blot和免疫熒光檢測(cè)siRNA對(duì)TIMP1干擾效率，結(jié)果顯示:相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染siRNA-TIMP1的SW-620細(xì)胞明顯低表達(dá)TIMP1蛋白。采用MTT法連續(xù)4d觀察si-TIMP1/SW-620細(xì)胞增殖速度，結(jié)果顯示從第二天開(kāi)始低表達(dá)TIMP1的SW-620細(xì)胞增殖速度減慢;表明si-TIMP1/SW-620較NC/SW-

15、620細(xì)胞增殖能力弱。以不同濃度梯度的5-FU分別作用于NC/SW-620和si-TIMP1/SW-62072h，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞IC50有明顯差異，si-TIMP1/SW-620較NC/SW-620耐藥性明顯降低。進(jìn)一步將NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細(xì)胞分別培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，腫瘤球生長(zhǎng)5d后，兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)比較兩組細(xì)胞腫瘤球直徑存在顯著性差異(t=13.929，P=0.000);
　　 第三章 RT

16、-PCR和Western blot分別檢測(cè)NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細(xì)胞MT1-MMP的表達(dá)水平，結(jié)果顯示si-TIMP1/SW-620細(xì)胞較NC/SW-620細(xì)胞明顯低表達(dá)MT1-MMP。Western blot檢測(cè)NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin和間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin，結(jié)果顯示si-TIMP1/SW-620細(xì)胞較NC/SW-620細(xì)胞可提高E-cad

17、herin表達(dá)，降低Vimentin表達(dá)。Western blot檢測(cè)NC/SW-620和si-TIMP1/SW-620細(xì)胞EMT標(biāo)記物ZEB1、ZEB2和SANI1，結(jié)果顯示si-TIMP1/SW-620細(xì)胞較NC/SW-620細(xì)胞ZEB1，ZEB2和SANI1表達(dá)降低。
　　 第四章鑒于常規(guī)的miRNA靶基因預(yù)測(cè)方法，通過(guò)Targetscan，miRanda和PicTar4三個(gè)miRNA生物信息網(wǎng)站，預(yù)測(cè)可能調(diào)節(jié)TIMP1的

18、潛在miRNAs，三種預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示miR-618同TIMP13'UTR有結(jié)合位點(diǎn)，miR-618可能通過(guò)結(jié)合于TIMP13'UTR調(diào)控TIMP1的表達(dá)。經(jīng)Targetscan在線程序分析提示miR-618與TIMP1 mRNA的82至88之間區(qū)域存在互補(bǔ)結(jié)合序列。miR-618轉(zhuǎn)染SW-620細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)miR-618的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-618/SW-620細(xì)胞較NC/SW-620細(xì)胞明顯高表達(dá)miR-618。miR-6

19、18轉(zhuǎn)染SW-620細(xì)胞，Westernblot和免疫熒光檢測(cè)TIMP1表達(dá)，結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-618的SW-620細(xì)胞明顯低表達(dá)TIMP1蛋白，提示miR-618與TIMP1之間存在著調(diào)控關(guān)系，miR-618可抑制TIMP1表達(dá)。于是我們構(gòu)建了pTIMP1-CDS，將pTIMP1-CDS轉(zhuǎn)染到SW-620和293T細(xì)胞并分別加入miR-618模擬物或抑制物處理48小時(shí)后，雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞總蛋白的熒光素變化

20、，發(fā)現(xiàn)miR-618 mimics作用這兩種細(xì)胞后海腎熒光素酶的活性明顯受抑制，僅為對(duì)照組的50％左右;而miR-618 inhibitor作用后海腎熒光素酶的活性呈現(xiàn)不同程度的增加。這些結(jié)果表明miR-618通過(guò)作用于pTIMP1-CDS片段，影響了海腎熒光素酶的表達(dá)。應(yīng)用原位雜交、免疫組織化學(xué)方法和QRT-PCR分別檢測(cè)38例結(jié)直腸癌組織中TIMP-1和miR-618表達(dá)水平，F(xiàn)isher確切概率法檢驗(yàn)結(jié)果顯示miR-618+/TI

21、MP-1-同miR-618+/TIMP-1+病例數(shù)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1、結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)上調(diào)大于4倍的基因有24個(gè)，其中包括TIMP-1;TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)亦明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，并與患者生存預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，預(yù)示其可能成為判斷結(jié)直腸癌進(jìn)展和預(yù)后的理想標(biāo)志物;
　　 2、沉默TIMP1的表達(dá)可顯著抑制SW-620

22、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和腫瘤球形成能力，提高SW-620結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性;進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾TIMP1的表達(dá)可抑制SW-620細(xì)胞MT1-MMP蛋白、間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin及EMT標(biāo)記物ZEB1、ZEB2和SANI1的表達(dá)，促進(jìn)上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá);
　　 3、miR-618可靶向作用于TIMP13'UTR調(diào)控TIMP1蛋白的表達(dá);此外在結(jié)腸癌標(biāo)本中，miR-618+/TIMP