EMT相關(guān)microRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與功能研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)90％的腫瘤患者死于腫瘤的轉(zhuǎn)移，常規(guī)的手術(shù)治療、化療、放療難以對(duì)其進(jìn)行有效逆轉(zhuǎn)，如何有效地早期檢測(cè)和靶點(diǎn)治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，尋找新的腫瘤標(biāo)志物以便及早診斷和進(jìn)行個(gè)體化治療，是降低癌癥惡性行為的關(guān)鍵，對(duì)結(jié)直腸癌防治有重大意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，EMT

2、現(xiàn)象與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在多種癌癥的原位浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。microRNA(miRNA)是一系列內(nèi)源性非編碼小RNA(通常長(zhǎng)度在18-25nt)的總稱(chēng)。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后起翻譯抑制作用，主要是通過(guò)與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslational region,3'UTR)結(jié)合達(dá)到抑制蛋白翻譯的生物學(xué)作用。最近發(fā)現(xiàn)miRNA在EMT過(guò)程中有重要的表達(dá)調(diào)控作用。隨著研究的深入，有關(guān)miRNA與腫瘤E

3、MT之間關(guān)系研究逐漸增多，但目前國(guó)內(nèi)外探討EMT相關(guān)miRNA在結(jié)直腸癌中的研究尚屬起步階段。
　　 研究方法和內(nèi)容:
　　 本研究小組的前期研究，采用EGF和TGF-β誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480發(fā)生EMT并采用miRNA芯片篩選出誘導(dǎo)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的差異miRNA分子，通過(guò)初步Real-time PCR驗(yàn)證，從中篩選出了3個(gè)差異miRNA分子: Hsa-miR-138、Hsa-miR-139-5p、Hsa-miR-1

4、180，本課題擬從細(xì)胞和分子水平證實(shí)相關(guān)分子在結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT過(guò)程中的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)特征，從臨床組織標(biāo)本水平驗(yàn)證相關(guān)差異miRNA分子的表達(dá)，并進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與靶基因驗(yàn)證的方法初步闡明相關(guān)miRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.EMT相關(guān)miRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞及臨床組織標(biāo)本中的表達(dá):(1) Real-time PCR連續(xù)多時(shí)間點(diǎn)驗(yàn)證miR-138、miR-1

5、39-5p、miR-1180的在結(jié)腸癌細(xì)胞EMT過(guò)程中的表達(dá)。驗(yàn)證結(jié)果與芯片相符。(2)Real-time PCR檢測(cè)24對(duì)癌組織及其配對(duì)正常粘膜組織中miR-138的表達(dá)。結(jié)果顯示在22對(duì)樣本中，miR-138在癌組織中的表達(dá)相較其配對(duì)正常粘膜明顯下調(diào)，僅2例癌組織中miR-138表達(dá)升高，具有顯著性差異，配對(duì)正常粘膜組/腫瘤組比值=2.66; miR-139-5p在18例配對(duì)標(biāo)本中檢測(cè)，結(jié)果顯示兩組間表達(dá)無(wú)顯著性差異。(3) miR

6、-138在結(jié)直腸癌、癌遠(yuǎn)端正常粘膜和淋巴結(jié)中的原位雜交結(jié)果顯示:miR-138在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯低于配對(duì)癌旁組織與癌遠(yuǎn)端正常粘膜，有顯著性差異;癌遠(yuǎn)端正常粘膜與癌遠(yuǎn)端正常粘膜相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;結(jié)直腸癌原發(fā)灶表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4) CRC臨床病理特征的相關(guān)性分析:組織芯片原位雜交結(jié)果表明，miR-138陽(yáng)性表達(dá)與性別、分化程度以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、Dukes分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。

7、　　 2.mir-138、mir-139-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能:Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明miR-138可以減弱SW480細(xì)胞的遷移侵襲能力，miR-139-5p可以增強(qiáng)SW480細(xì)胞的遷移侵襲能力，流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果表明miR-138能明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減慢細(xì)胞周期進(jìn)程，miR-139-5p對(duì)細(xì)胞周期及凋亡影響不明顯，MTT及劃痕試驗(yàn)表明miR-138可抑制HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，并可明顯抑制SW480細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能

8、力。
　　 3.miR-138、miR-139-5p調(diào)控的靶基因預(yù)測(cè)及鑒定:(1)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果提示miR-138的靶基因參與TGF-β、Pathway incancer等通路;miR-139-5p的靶基因參與Pathway in cancer、Colorectalcancer pathway等通路。結(jié)合預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)一步選擇CDH1、VIM、CD44、EZR、ZEB2、CTNNA1/2、FN1、MMP2等基因進(jìn)行驗(yàn)證。(2

9、) Real-timePCR檢測(cè)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-138、miR-139-5p過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)載體后target gene的表達(dá)以及TGF-β處理SW480細(xì)胞48h使其發(fā)生EMT，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-138、miR-139-5p過(guò)表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體后，Real-time PCR檢測(cè)預(yù)測(cè)的target gene表達(dá)，結(jié)果初步提示miR-138target gene為EZR,miR-139-5p target gene為CDH

10、1、ZEB2。(3)熒光素酶實(shí)驗(yàn):構(gòu)建了含EZRIN與miR-138結(jié)合位點(diǎn)及其缺失突變型的PMIR載體，含CDH1、ZEB2與miR-139-5p結(jié)合位點(diǎn)及其缺失突變型的PMIR載體，采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，結(jié)果提示:EZRIN是miR-138調(diào)控的靶基因，CDH1是miR-139-5p下游調(diào)控的靶基因。(4)Western-blot證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-138及miR-139-5p前后EZRIN、CDH1蛋白表達(dá)下調(diào)，表明:EZRIN受mi

11、R-138的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，CDH1受miR-139-5p的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　 結(jié)論:
　　 1.miR-138在結(jié)直腸癌組織和TGF-β誘導(dǎo)發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中均表達(dá)下調(diào)。
　　 2.miR-138可抑制HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，抑制SW480細(xì)胞的遷移和侵襲，并可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯G1期細(xì)胞生長(zhǎng);miR-138可通過(guò)作用于靶基因EZRIN而發(fā)揮其抑制結(jié)腸癌EMT轉(zhuǎn)化的功能。