粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)動(dòng)脈系統(tǒng)中慢性阻塞性病變作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是廣泛應(yīng)用于放療和化療患者動(dòng)員干祖細(xì)胞支持造血恢復(fù)的細(xì)胞因子。近來研究表明,G-CSF可動(dòng)員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入循環(huán),促使心肌再生和血管新生而改善心臟功能。作為非侵入性治療,因此有可能更廣泛應(yīng)用于心肌梗死及慢性缺血性心臟病,具備廣闊的臨床前景。但目前相關(guān)研究多局限于它對(duì)心臟的作用及機(jī)制,對(duì)于血管,尤其是與缺血性心臟病緊密相關(guān)的慢性動(dòng)脈阻塞性病變,鮮有報(bào)道。另外,G-CSF動(dòng)員后,直接效應(yīng)是導(dǎo)致白細(xì)胞增多,可能引

2、起高凝狀態(tài)。這是否會(huì)誘發(fā)動(dòng)脈阻塞病變的惡化,目前亦尚未明確?？傊?G-CSF對(duì)動(dòng)脈系統(tǒng)及慢性阻塞血管局部的影響,國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界尚無定論。
　　 新近許多研究證實(shí),骨髓、外周血、臍血中存在著內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs),,在損傷信號(hào)的刺激下能被招募到血管損傷局部,分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞,參與血管新生和修復(fù)。G-CSF作為外源性干細(xì)胞動(dòng)員劑,能刺激骨髓中EPCs進(jìn)入外周血,加速損傷血管的

3、再內(nèi)皮化。結(jié)合上述不良反應(yīng),由此我們推斷,其必然對(duì)局部血管,包括慢性動(dòng)脈阻塞性病變及動(dòng)脈系統(tǒng)本身也存在修復(fù)作用甚至副作用。
　　 慢性動(dòng)脈阻塞性病變作為一種血管損傷,是一系列常見的影響人類健康的心血管疾病,改變的不僅僅是血管的形態(tài)和結(jié)構(gòu),更重要的是其功能的變化?；诖?本研究從形態(tài)和功能兩方面系統(tǒng)地闡述這個(gè)問題。
　　 實(shí)驗(yàn)分以下四部分:
　　 第一部分兔頸動(dòng)脈慢性阻塞模型的構(gòu)建及影像學(xué)評(píng)價(jià)的研究
　　

4、目的:制備新型兔頸總動(dòng)脈慢性阻塞動(dòng)物模型,為下一步研究粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)動(dòng)脈慢性阻塞性病變的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:健康實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔18只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、4周組和8周組,每組6只;利用右頸總動(dòng)脈植入動(dòng)脈縮窄環(huán)制備慢性動(dòng)脈阻塞模型;應(yīng)用頸動(dòng)脈超聲以及血管磁共振的影像學(xué)手段隨訪評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建效果;術(shù)后4周(4周組)或8周(8周組)處死動(dòng)物,分離慢性阻塞縮窄環(huán)近端及遠(yuǎn)端行病理學(xué)檢查并用掃描電鏡、Real-timePCR檢測(cè)eNOS

5、和ET-1mRNA評(píng)估阻塞區(qū)域局部?jī)?nèi)皮結(jié)構(gòu)功能的變化。結(jié)果:18只實(shí)驗(yàn)兔中17頭成活,并成功建立頸總動(dòng)脈慢性阻塞模型兔11只;植入動(dòng)脈縮窄環(huán)后,4周即見頸總動(dòng)脈逐步阻塞,頸總動(dòng)脈超聲隨訪顯示血管內(nèi)徑從術(shù)前(2.00±0.1)cm下降至(1.33±0.23)cm,狹窄程度達(dá)到(48±7)％;到第8周時(shí),血管內(nèi)徑更是顯著下降至(0.48±0.06)cm,狹窄達(dá)到(95±3)％,與對(duì)照組及4周組相比,變化絕對(duì)值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),

6、同時(shí)血流速度及阻力指數(shù)亦有顯著變化;兔頸總動(dòng)脈磁共振顯示造模前清晰可見,雙側(cè)基本對(duì)稱,血管內(nèi)徑為(2.02±0.15)cm,但造模4周后右側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄環(huán)部位明顯狹窄(1.56±0.18)cm,8周后幾乎完全阻塞,僅殘留細(xì)線痕跡,與假手術(shù)組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相應(yīng)血管段病理檢查發(fā)現(xiàn)造模后內(nèi)膜繼續(xù)增厚,細(xì)胞外基質(zhì)增加,以致管腔重度狹窄甚至閉塞;電鏡掃描證實(shí)慢性阻塞后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,基質(zhì)表面顆粒狀物增大;Real-time

7、PCR可見慢性阻塞動(dòng)脈遠(yuǎn)端血管ET-1基因的上調(diào)和eNOS基因的下調(diào)及對(duì)側(cè)動(dòng)脈的代償性變化。結(jié)論:應(yīng)用動(dòng)脈收縮環(huán)4周后即可以成功制作慢性動(dòng)脈阻塞性病變動(dòng)物模型,8周更為顯著,并出現(xiàn)相應(yīng)血管段內(nèi)皮形態(tài)及功能變化。
　　 第二部分粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對(duì)動(dòng)脈慢性阻塞病變局部血管段的影響
　　 目的:利用慢性動(dòng)脈阻塞性病動(dòng)物模型,隨訪觀察G-CSF應(yīng)用過程中血管局部功能和基質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化,探索G-CSF治療心血管疾病時(shí)

8、對(duì)局部慢性阻塞病變動(dòng)脈的影響,再評(píng)價(jià)其安全性,從而為臨床實(shí)踐提供新的理論依據(jù)。方法:健康實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔36只,先隨機(jī)分為高脂喂養(yǎng)及普通喂養(yǎng)2組,再各自細(xì)分為3亞組分別為假手術(shù)組、慢性動(dòng)脈阻塞性模型組和慢性動(dòng)脈阻塞性模型加G-CSF干預(yù)組,每組6只;采用高脂喂養(yǎng)制備動(dòng)脈粥樣硬化模型;G-CSF干預(yù)為15μg/kg/d,皮下注射,連續(xù)5天,采用Giemsa染色及白細(xì)胞計(jì)數(shù)證實(shí)動(dòng)員效果;造模前后做血常規(guī)及血脂生化檢測(cè),后2月取材截取慢性阻

9、塞及對(duì)應(yīng)部位局部頸總動(dòng)脈做分子實(shí)驗(yàn)(PCR和WB)及病理學(xué)分析;造模后第3、5、7周進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈超聲隨訪;膠原染色、MMP-9/TIMP-2免疫組化及WB研究血管基質(zhì)結(jié)構(gòu)變化;掃描電鏡、Real-timePCR檢測(cè)eNOS和ET-1mRNA評(píng)估相應(yīng)血管內(nèi)皮形態(tài)及功能的變化。
　　 結(jié)果:成功制備慢性阻塞性頸總動(dòng)脈病變動(dòng)物模型24只;高脂喂養(yǎng)2月后,高脂喂養(yǎng)3組總膽固醇、低密度脂蛋白(TC、LDL)等血脂水平明顯升高,動(dòng)脈粥樣

10、硬化指數(shù)(AI)由(1.21±0.16)升至(2.70±0.74),P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;G-CSF動(dòng)員后Giemsa染色可見粒細(xì)胞數(shù)目明顯增加,同白細(xì)胞計(jì)數(shù)上升一致;造模3周后,頸動(dòng)脈超聲見近端頸總動(dòng)脈血管內(nèi)徑逐步變小,血流速度變慢,阻力指數(shù)增高,應(yīng)用G-CSF后變化更顯著,高脂喂養(yǎng)兔狹窄度從(53.24±0.7)％升至(59.51±0.5)％,P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;5周后,血管陸續(xù)阻塞直至完全閉合,超聲可見動(dòng)脈粥樣硬化血

11、管更易閉合,G-CSF可使完全阻塞時(shí)間提前2周達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而普通喂養(yǎng)兔需7周左右;病理分析HE染色可見G-CSF使內(nèi)膜明顯增生,內(nèi)皮皺褶增多;膠原染色發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)能使兔動(dòng)脈硬化表現(xiàn)為肌纖維略減少而膠原、淀粉樣變等物質(zhì)增多,慢性阻塞后近端血管更顯著,而G-CSF干預(yù)加劇類似變化;WesternBlot證實(shí)G-CSF與動(dòng)脈粥樣硬化一樣均可使血管MMP-9和TIMP-2表達(dá)上調(diào),加重阻塞病變;Real-timePCR發(fā)現(xiàn)G-CSF上調(diào)慢性

12、阻塞動(dòng)脈遠(yuǎn)端血管eNOS基因下調(diào)ET-1基因伴隨對(duì)側(cè)動(dòng)脈代償性變化,表達(dá)量經(jīng)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);電鏡掃描發(fā)現(xiàn)慢性阻塞動(dòng)脈近端應(yīng)用G-CSF促使內(nèi)皮細(xì)胞增生,但在遄流下作用有限。結(jié)論:G-CSF動(dòng)員具有促內(nèi)皮化改善內(nèi)皮功能的作用,但如高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化一樣,均可加重局部慢性動(dòng)脈阻塞性病變,這可能與其惡化動(dòng)脈粥樣硬化以及誘導(dǎo)血管基質(zhì)蛋白酶的表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)纖維增生有關(guān)。
　　 第三部分粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)對(duì)

13、慢性阻塞病變動(dòng)脈系統(tǒng)的整體作用
　　 目的:系統(tǒng)地研究G-CSF在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其對(duì)不同類型的動(dòng)脈內(nèi)皮的影響,結(jié)合功能與形態(tài)學(xué)觀察,分析G-CSF對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等全身性動(dòng)脈慢性阻塞病變的整體作用,指導(dǎo)臨床最大效能地發(fā)揮其良好效應(yīng),防止不良作用。方法:30只健康實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔,隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)、普通喂養(yǎng)+G-CSF組(n=8)、高脂喂養(yǎng)組(n=8)、高脂喂養(yǎng)+G-CSF組(n=8);+G-CSF為15ug/kg

14、G-CSF用生理鹽水稀釋成0.5mL,每日皮下注射,連續(xù)5日,隔周進(jìn)行,共4次;每周采血,硝酸還原酶法測(cè)定血清NO濃度,全自動(dòng)血生化分析儀測(cè)量4組血脂;10周后取材,蘇丹Ⅲ脂肪染色分析胸主動(dòng)脈脂肪斑塊;HE染色分析頸總動(dòng)脈、股動(dòng)脈及胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度;膠原染色和免疫組化分析各組胸主動(dòng)脈血管基質(zhì)情況;逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定頸總動(dòng)脈、股動(dòng)脈及胸主動(dòng)脈MMP-9、TIMP-2、eNOS及ET-I.mRNA表達(dá);Western-B

15、lot檢測(cè)不同動(dòng)脈段血管內(nèi)MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá);掃描電鏡觀察各動(dòng)脈段內(nèi)皮表面形態(tài),透射電鏡觀察各組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)線粒體的變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)期間8只兔子死亡,最終4組分別存活有5、6、5、6只動(dòng)物,達(dá)到實(shí)驗(yàn)完成要求;血脂動(dòng)態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)能使TC、LDL等血脂水平上升,6周后高峰,與對(duì)照組相比,P＜0.05,但8周后就趨于穩(wěn)定;+G-CSF使血脂高峰前移,使TC、LDL等提前2周就與對(duì)照組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05)

16、,并有雙峰樣改變,但對(duì)TG同樣無影響;NO監(jiān)測(cè)提示G-CSF使血漿NO水平迅速升高,與對(duì)照組相比,2周即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而單純高脂喂養(yǎng)組則較遲緩,4周以后才逐步上升,差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);同時(shí)G-CSF干預(yù)組最高最快,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);蘇丹Ⅲ染色發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)組胸主動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣斑塊,+G-CSF則使斑塊面積比從(57.40±1.68)％上升至(91.18±2.27)％,P＜0.05;HE染色

17、發(fā)現(xiàn)+G-CSF使普通喂養(yǎng)組內(nèi)膜厚度比值從(8.77±0.89)％上升至(11.10±1.50)％,高脂喂養(yǎng)分別為(14.97±1.87)％,(25.83±1.88)％,后者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);胸主動(dòng)脈膠原染色提示G-CSF能使基質(zhì)增生,免疫組化證實(shí)其上調(diào)MMP-9及TIMP-2的陽(yáng)性率,4組依次分別為(1.08±0.06)％、(26.31±1.08)％、(27.90±1.07)％、(45.51±1.60)％,(4.07±1.

18、01)％、(36.08±1.68)％、(71.36±3.01)％、(67.26±2.54)％;MMP-9及TIMP-2mRNART-PCR的結(jié)果與以上相符,eNOS、ET-1mRNA的表達(dá)提示高脂喂養(yǎng)兔形成動(dòng)脈粥樣硬化后,反映內(nèi)皮功能損害的ET-1基因表達(dá)依序?yàn)樾刂鲃?dòng)脈＞頸總動(dòng)脈＞股動(dòng)脈,而反映內(nèi)皮功能良好的eNOS基因則反之,+G-CSF在普通喂養(yǎng)組出現(xiàn)eNOS基因的上調(diào)但高脂喂養(yǎng)組則下調(diào),ET-1基因的變化趨勢(shì)正好相反,此變化以胸主

19、動(dòng)脈為著,中小型動(dòng)脈如頸總動(dòng)脈、股動(dòng)脈次之;電鏡掃描發(fā)現(xiàn)高脂使EC凋亡增加,G-CSF能使EC數(shù)目增加,對(duì)正常動(dòng)脈作用更大,但對(duì)粥樣硬化動(dòng)脈表面影響不明顯;透射電鏡則提示高脂喂養(yǎng)和G-CSF使細(xì)胞線粒體等超微結(jié)構(gòu)病理改變嚴(yán)重,以兩者累加為最。結(jié)論:G-CSF對(duì)血脂存在影響,以TC、LDL為主,對(duì)TG作用不大。因此它可使動(dòng)脈粥樣硬化惡化,具體表現(xiàn)為斑塊面積的擴(kuò)大,內(nèi)膜厚度增加,可能與其對(duì)基質(zhì)的影響有關(guān);高脂喂養(yǎng)兔能成功制造動(dòng)脈粥樣硬化模型

20、,成模后動(dòng)脈內(nèi)皮功能顯著受損,其中以大型動(dòng)脈顯著,同時(shí)內(nèi)皮形態(tài)出現(xiàn)相應(yīng)變化;G-CSF對(duì)全身動(dòng)脈系統(tǒng)都有影響,但動(dòng)脈越小,影響越小;正常與粥樣硬化動(dòng)脈內(nèi)皮形態(tài)及功能改變之間存在必然聯(lián)系,其對(duì)G-CSF的反應(yīng)也不同。
　　 第四部分粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)活化血小板功能參與慢性動(dòng)脈阻塞
　　 目的:探討G-CSF在應(yīng)用于干細(xì)胞動(dòng)員治療心血管疾病時(shí)是否活化血小板功能參與慢性動(dòng)脈阻塞性病變。方法:16只雄性新西蘭大白兔

21、隨機(jī)分為普通和高脂喂養(yǎng)2組,15ug/kgG-CSF用生理鹽水稀釋成0.5mL,每日皮下注射,連續(xù)5日,用藥前后分別用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血小板比積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、大血小板比例(P-LCR);雙抗體夾心免疫酶聯(lián)試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定TX_B2、P選擇素等血小板相關(guān)指標(biāo);采用全血CD41-FITC/CD62P、CD63-PE熒光抗體雙標(biāo)流式分析法對(duì)血小板活化標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證;血小板聚集儀直接測(cè)定血小板聚

22、集能力的前后變化。結(jié)果:用藥后普通喂養(yǎng)組除PLT計(jì)數(shù)外上述各項(xiàng)指標(biāo)與基礎(chǔ)狀態(tài)相比均增高,但高脂喂養(yǎng)組除P-LCR外,其他指標(biāo)無顯著變化;用藥前高脂喂養(yǎng)組的P-選擇素、TXB2高于普通喂養(yǎng)組,但用藥前后這兩項(xiàng)指標(biāo)變化不如普通喂養(yǎng)組顯著,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,普通喂養(yǎng)組P-選擇素、TXB2前后依次分別為(16.39±2.23)ng/ml、(40.62±19.37)ng/ml,(243.09±32.7)ng/ml、(473.87±80.17)ng/m

23、l,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);全血流式分析發(fā)現(xiàn)普通喂養(yǎng)組兔子血小板活化狀態(tài)在G-CSF應(yīng)用前后變化較大,CD62P的陽(yáng)性率分別為(0.2±0.01)％、(4.57±0.24)％,CD63的陽(yáng)性率分別為(1.09±0.06)％、(7.14±0.62)％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);血小板聚集功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)組只有最大聚集率(Amax)在用藥前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,(33.51±0.55)％vs.(38.23±0.67)％,P＜

24、0.05;而最大聚集時(shí)間(Tmax)和第一分鐘聚集率(A1)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);普通喂養(yǎng)組則三項(xiàng)指標(biāo)在用藥前后都出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,(12.64±0.63)％vs.(36.9±0.73)％,(3.9±0.27)秒vs.(2.19±0.19)秒,(24.58±0.47)％vs.(45.58±0.96)％,P＜0.05;高脂喂養(yǎng)組最大聚集率(Amax)和第一分鐘聚集率(A1)均顯著大于普通喂養(yǎng)組,(33.51±0.55)％vS.(1

25、2.64±0.63)％,(42.05±0.81)％vs.(24.58±0.47)％,P＜0.05。
　　 結(jié)論:G-CSF在動(dòng)員作用高峰能引發(fā)血小板功能的活化,其機(jī)制可能與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān):高血脂本身就是刺激因素,有激活血小板的作用,在此應(yīng)激基礎(chǔ)上G-CSF的活化作用有所鈍化;P-LCR是能夠反應(yīng)血小板活化的早期指標(biāo),全血細(xì)胞流式分析是檢測(cè)血小板活化的較靈敏方法,聚集率測(cè)定能夠直接判斷血小板的活化程度;結(jié)合以上研究,我們推斷活化的血

26、小板有可能參與了動(dòng)脈的慢性阻塞病變。
　　 潛在價(jià)值和創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1.創(chuàng)建了新型慢性動(dòng)脈阻塞性病變模型,具有操作簡(jiǎn)便,成功率高,便于隨訪,能夠自身對(duì)照等優(yōu)點(diǎn),為該系列動(dòng)脈疾病研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ);
　　 2.實(shí)現(xiàn)了動(dòng)脈縮窄環(huán)的國(guó)產(chǎn)化,效果確切可靠,填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白,已在申請(qǐng)國(guó)家專利;
　　 3.將形態(tài)學(xué)觀察與功能檢測(cè)緊密聯(lián)系,比較全面地描述了G-CSF對(duì)動(dòng)脈尤其慢性阻塞局部?jī)?nèi)皮的變化;