佛波酯聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)人骨髓造血作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　骨髓抑制是腫瘤病人化、放療后常見(jiàn)的毒副作用，輕度骨髓抑制在應(yīng)用G-CSF、EPO、TPO等藥物后多可快速恢復(fù)，但是高劑量的放、化療或長(zhǎng)期的化療?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的骨髓抑制，重度的骨髓抑制增加了患者感染、出血的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重者甚至危及生命。此時(shí)僅應(yīng)用G-CSF、EPO并不能在短期內(nèi)有效的恢復(fù)造血?；熕幬镌跉缒[瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)骨髓中的造血各階段細(xì)胞和骨髓微環(huán)境都有損害，然而目前常用的升血藥物則主要作用于下游階段的造血前體細(xì)胞

2、。如G-CSF就是作用于骨髓粒系造血祖細(xì)胞階段，然后刺激其增殖，向下游分化，并促進(jìn)成熟的中性粒細(xì)胞釋放到循環(huán)中;EPO作用于紅系造血祖細(xì)胞階段，刺激紅系造血，增加外周血中紅細(xì)胞數(shù)量，并且兩者對(duì)骨髓的造血微環(huán)境均無(wú)特別的影響。因此在重度骨髓抑制時(shí)期，尋找一種能夠快速有效的促進(jìn)骨髓造血的方法很有必要。研究發(fā)現(xiàn)12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，簡(jiǎn)稱佛波酯(TPA)，不僅可以誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，而且發(fā)現(xiàn)它有促進(jìn)造血的作用。<

3、br>　　目的：
　　體外觀察TPA單用或聯(lián)合G-CSF對(duì)AML患者化療后骨髓抑制時(shí)期的骨髓造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的影響。
　　方法：
　　1、利用甲基纖維素半固體培養(yǎng)的方法體外培養(yǎng)來(lái)自AML患者化療后處于骨髓抑制期的骨髓細(xì)胞，同一批實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)自同一位患者的同一個(gè)骨髓樣本。分組:空白對(duì)照組，TPA單用組（終濃度10 ng/ml），G-CSF單用組（終濃度50ng/ml），TPA與G-CSF聯(lián)合組（終濃度分別為10 ng/m

4、l+50ng/ml），不同組別的藥物分別加入到不含任何刺激因子的不完全培養(yǎng)基中和含EPO、白細(xì)胞條件培養(yǎng)液的完全培養(yǎng)基中觀察CFU-GEMM、CFU-GM、BFU-E、CFU-E等集落的形成情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。
　　2、不完全甲基纖維半固體培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的TPA，終濃度范圍0.1～30ng/ml，并設(shè)置空白對(duì)照，觀察CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-E集落的形成情況。
　　3、不完全甲基纖維半固體

5、培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的TPA并聯(lián)合G-CSF（50ng/ml），TPA的終濃度范圍為0.1～30 ng/ml，并設(shè)置空白對(duì)照，觀察CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-E集落的形成情況。
　　4、體外分別培養(yǎng)健康人基質(zhì)細(xì)胞和AML患者化療后骨髓抑制期抽取的骨髓獲得的基質(zhì)細(xì)胞，給予不同濃度的TPA，終濃度分別為0.1ng/ml、1.0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml

6、，設(shè)置對(duì)照。用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖或抑制情況。
　　結(jié)果：
　　1、不完全培養(yǎng)基中的四組形成集落比較，對(duì)照組在培養(yǎng)24-72小時(shí)可見(jiàn)到小細(xì)胞團(tuán)，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞均死亡，培養(yǎng)14天計(jì)數(shù)，對(duì)照組無(wú)集落形成，TPA單用或聯(lián)合均能刺激CFU-GM，CFU-GEMM和BFU-E形成，主要是粒單系集落的形成;G-CSF單用只能形成CFU-GM，對(duì)紅系和早期的混合系集落形成無(wú)影響;TPA和G-CSF可以協(xié)同促進(jìn)CFU-GM集落的形

7、成(P＜0.05)，但是兩者聯(lián)合對(duì)CFU-GEMM和BFU-E集落的形成無(wú)促進(jìn)作用（P均＞0.05）。
　　2、不完全培養(yǎng)基中的不同濃度TPA刺激后形成集落比較，0.1～30ng/ml濃度范圍內(nèi)可以見(jiàn)到CFU-GM集落的形成，1～20ng/ml濃度范圍內(nèi)可以見(jiàn)到早期混合系集落CFU-GEMM的形成，5～20ng/ml濃度范圍內(nèi)可以見(jiàn)到BFU-E集落形成。單用TPA時(shí)最佳的刺激CFU-GM和CFU-GEMM集落形成的終濃度均是5～1

8、0ng/ml，比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而較小終濃度或加大終濃度均不能提高集落的形成。單用TPA最佳的刺激BFU-E集落形成的終濃度是10ng/ml時(shí)，該濃度組形成的集落產(chǎn)率最高(P均＜0.05)。
　　3、不完全培養(yǎng)基中的不同濃度TPA聯(lián)合G-CSF（終濃度50ng/ml）刺激后形成集落比較，形成的主要是髓系集落CFU-GM，也有少量的混合系集落CFU-GEMM，TPA終濃度為1ng/ml～20 ng/ml的聯(lián)合組中尚

9、可以觀察后少量的BFU-E。TPA和50ng/mlG-CSF聯(lián)合時(shí)最佳的刺激CFU-GM形成的終濃度是1ng/ml～5ng/ml(P均＜0.05)。TPA終濃度為5ng/ml的聯(lián)合組中的CFU-GEMM集落產(chǎn)率最高，5～20ng/ml的終濃度組中的BFU-E集落產(chǎn)率較高。
　　4、完全培養(yǎng)基中的四組祖細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果，四組中均可以看到CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E和CFU-E集落形成。四組CFU-GM產(chǎn)率比較，聯(lián)合組的CF

10、U-GM集落產(chǎn)率最多(P＜0.05)，四組CFU-GEMM產(chǎn)率比較，TPA組和聯(lián)合組均較對(duì)照組和 G-CSF組的CFU-GEMM集落產(chǎn)率高（P均＜0.05），但是TPA組和聯(lián)合組的集落產(chǎn)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.98);聯(lián)合組和TPA組的BFU-E比較無(wú)差別(P=0.38);四組的CFU-E產(chǎn)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.34)。
　　5、TPA在終濃度為5-20ng/ml對(duì)于健康人的基質(zhì)細(xì)胞（細(xì)胞個(gè)數(shù)2×105個(gè)/ml）表現(xiàn)為促

11、進(jìn)增殖的作用，小于或大于這個(gè)濃度范圍均對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為抑制作用，5ng/ml是最佳的促進(jìn)增殖濃度。TPA在濃度為5～30ng/ml的濃度范圍內(nèi)均可以促進(jìn)AML骨髓抑制期患者的骨髓基質(zhì)細(xì)胞（細(xì)胞個(gè)數(shù)2×105個(gè)/ml）的生長(zhǎng)，10ng/ml是最佳的促進(jìn)增殖濃度。而G-CSF對(duì)健康或AML患者的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增長(zhǎng)無(wú)影響。
　　結(jié)論：
　　1、TPA體外單獨(dú)用藥可以促進(jìn)人CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E的形成，主要是

12、CFU-GM，最佳的作用終濃度為5～10ng/ml。
　　2、TPA可以協(xié)同G-CSF促進(jìn)人CFU-GM集落的生成，和G-CSF50ng/ml聯(lián)合時(shí)TPA最佳的作用終濃度為1～5ng/ml。TPA和G-CSF聯(lián)合對(duì)CFU-GEMM和BFU-E集落的形成無(wú)協(xié)同作用。
　　3、G-CSF體外單獨(dú)用藥可以促進(jìn)人CFU-GM的形成，但是對(duì)CFU-GEMM、BFU-E的形成無(wú)影響。
　　4、TPA體外單獨(dú)用藥可以促進(jìn)健康人和AM