芽孢桿菌遺傳操作體系初建及工程菌株分子改良.pdf

1、芽孢桿菌（Bacillus）是革蘭氏陽性菌，不含內(nèi)毒素，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌到胞外，是多種重要工業(yè)酶的生產(chǎn)菌株。隨著分子生物學和基因工程的迅速發(fā)展，芽孢桿菌作為基因表達系統(tǒng)得以不斷完善，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本研究旨在建立和優(yōu)化枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達系統(tǒng)，對工業(yè)用野生型芽孢桿菌的遺傳操作系統(tǒng)進行改良，以進一步提高工程菌株的表達量，并建立具有應(yīng)用潛力的芽孢桿菌高效表達體系。
　　本文首先對枯草芽孢桿菌表

2、達系統(tǒng)載體進行建立及優(yōu)化，其中包括含有不同啟動子的表達載體（如：組成型啟動子P43、乳糖誘導型啟動子Pgrac、木糖誘導型啟動子Pxyl、淀粉酶啟動子PamyQ）、含有不同篩選標記的克隆載體（如：卡那霉素Kan、紅霉素Em、氯霉素Cm、四環(huán)素Tet）、以及含不同整合位點的整合載體的構(gòu)建；其次對枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法進行優(yōu)化，有效的提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，從而建立了一套完善的枯草芽孢桿菌表達技術(shù)，為外源基因的高效分泌和表達提供平臺。利用該表達體

3、系，實現(xiàn)了氨肽酶基因 lapB在枯草芽孢桿菌中的高效表達，其搖瓶水平上的酶活達到了58.8 U/mL。
　　通過菌種改良獲得了能夠進行內(nèi)源性 BamHI甲基化修飾的枯草芽孢桿菌菌株，通過對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的甲基化修飾，以及感受態(tài)制備條件的摸索，建立了中溫α-淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)菌株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens BF.7658的遺傳轉(zhuǎn)化方法。以該高效分泌淀粉酶的菌株為宿主菌，實現(xiàn)了堿性蛋白酶基因的高效異源分泌

4、表達，重組解淀粉芽孢桿菌工程菌株 AprEA在搖瓶培養(yǎng)72小時的分泌表達水平可達7800 U/mL，具有較好的應(yīng)用潛力。
　　解淀粉芽孢桿菌K11是本研究室保存的一株能高效分泌中性蛋白酶的野生型菌株，在搖瓶水平上其中性蛋白酶分泌水平可達到2700 U/mL。為進一步提高其中性蛋白酶的表達水平，本研究克隆了解淀粉芽孢桿菌K11的中性蛋白酶基因K11npr，并構(gòu)建了游離型表達載體pKan300-K11npr和pUB110-K11npr

5、。將多拷貝的游離型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化K11菌株后獲得解淀粉芽孢桿菌重組菌F20和110N-6。重組菌F20和110N-6在牛奶初篩平板上的蛋白酶活性明顯要高于野生型菌株K11。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，重組菌110N-6在搖瓶水平上的酶活力可達到8995 U/mL，比野生型菌株提高了2倍多，在15升發(fā)酵罐的酶活力可達到24,000-28,000 U/mL，是目前已報道表達水平最高的中性蛋白酶。
　　重組表達質(zhì)粒的不穩(wěn)定性很大程度上限制了含高拷貝

6、游離質(zhì)粒的重組芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用。本研究所構(gòu)建的兩個游離型表達載體 pKan300-K11npr和 pUB110-K11npr，其最大的差異是前者含有能在大腸桿菌中復制的pBR322-ori復制元件，而后者中只含有芽孢桿菌復制元件。對重組菌的遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明：重組菌F20的遺傳穩(wěn)定性遠遠不如重組菌110N-6，在無選擇壓力的培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，重組菌F20傳至第八代后質(zhì)粒即全部丟失，而重組菌110N-6傳至一百代，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍保持在

7、90％以上。推測表達載體中同時含有兩種不同的復制元件可能是質(zhì)粒在芽孢桿菌中不穩(wěn)定的重要原因之一。本研究所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUB110-K11npr在菌株110N-6中非常穩(wěn)定，可以滿足工業(yè)化大生產(chǎn)要求。
　　枯草芽孢菌株AS.1398是經(jīng)過長期誘變獲得的表達中性蛋白酶的商業(yè)菌株。通過研究不同濃度的氨芐青霉素對菌株細胞壁合成的抑制作用，建立了AS.1398菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法。將重組表達載體pUB110-K11npr導入AS.1398菌