布氏白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及穩(wěn)定高效表達(dá)Pr1蛋白酶工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、白僵菌(Beauveria)是應(yīng)用和研究最廣的昆蟲(chóng)病原真菌之一，也是目前微生物農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)之一。白僵菌對(duì)害蟲(chóng)致病性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、殺蟲(chóng)范圍廣，不傷害其他天敵昆蟲(chóng)和有益生物，可以有效地與其它殺蟲(chóng)因子協(xié)同作用并維持物種的多樣性，容易大量生產(chǎn)、無(wú)殘毒、害蟲(chóng)不產(chǎn)生抗性，相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥，有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但作為一種昆蟲(chóng)病原真菌，白僵菌同時(shí)也存在著殺蟲(chóng)速度慢、效率低、防治效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，大大影響了其殺蟲(chóng)效果。昆蟲(chóng)病原真菌通過(guò)體壁接觸感

2、染導(dǎo)致害蟲(chóng)死亡，在侵染昆蟲(chóng)體壁過(guò)程中分泌一系列胞外水解酶如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶、纖維素酶等，形成一個(gè)相互作用的復(fù)雜體系，降解昆蟲(chóng)體壁并主動(dòng)引起昆蟲(chóng)致病直至死亡。其中，類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-like protease，Prl)在降解昆蟲(chóng)體壁并激活昆蟲(chóng)免疫自毒體系，引起害蟲(chóng)致病過(guò)程中起主要作用，是其重要的毒力因子。已有研究證實(shí)，通過(guò)增加Prl基因的拷貝數(shù)，提高表達(dá)水平，并改變其為組成型表達(dá)模式，可明顯提高轉(zhuǎn)化體的殺蟲(chóng)毒

3、力。 利用基因工程技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良，構(gòu)建高酶活高抗性的白僵菌工程菌，提高毒力因子的活性，并加強(qiáng)白僵菌致病分子機(jī)理的研究，對(duì)充分實(shí)現(xiàn)該菌的生物防治作用具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)白僵菌表皮降解蛋白酶基因的研究主要集中在對(duì)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的研究上，而對(duì)布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)表皮降解蛋白酶基因的研究未見(jiàn)報(bào)道。由于布氏白僵菌侵染昆蟲(chóng)有其特定的寄主譜，因而有必要開(kāi)展

4、布氏白僵菌殺蟲(chóng)毒力分子生物學(xué)的研究。 本課題在本實(shí)驗(yàn)室前期克隆得到的布氏白僵菌Prl蛋白酶基因序列和cDNA序列的基礎(chǔ)上展開(kāi)。主要內(nèi)容包括： ①根據(jù)布氏白僵菌Prl基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以含有Prl基因全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pGEM-T-PrlcDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到含有Prl基因ORF序列的DNA片段。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBV220-PrlcDNA ORF(6XHis)，并導(dǎo)入大腸桿菌XLOLR。通過(guò)重組Prl

5、蛋白酶包涵體純化和變性溶解，鎳離子螯和柱純化，透析復(fù)性等一系列處理，酶活測(cè)定結(jié)果表明，成功實(shí)現(xiàn)了布氏白僵菌Prl蛋白酶基因在Ecoli中的表達(dá)，其比酶活為0.288 Umg<'-1>蛋白。 ②建立了根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的布氏白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。將草丁磷除草劑抗性bar基因作為篩選標(biāo)記，構(gòu)建了含絲狀真菌組成型bar基因表達(dá)元件的根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，建立了根瘤農(nóng)桿菌雙元載體體系，并對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的主要因素布氏白僵菌孢子濃度，根瘤農(nóng)桿菌與

6、布氏白僵菌孢子共培養(yǎng)時(shí)間及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的乙酰丁香酮(下簡(jiǎn)稱AS)的濃度三個(gè)限制條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)布氏白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化條件為：根瘤農(nóng)桿菌與布氏白僵菌共培養(yǎng)混合物中自僵菌分生孢子濃度為10<'5>個(gè)/ml，AS濃度為400μmol/L，共培養(yǎng)時(shí)間48 hour。根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)布氏白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系得建立，為從基因水平，利用分子生物學(xué)手段對(duì)布氏白僵菌進(jìn)行改造，得到穩(wěn)定高效的殺毒工程菌株奠定了基礎(chǔ)。③實(shí)現(xiàn)了昆蟲(chóng)病原真菌的重要毒力因子—

7、—類枯草桿菌蛋白酶Prl在布氏白僵菌中的組成型超表達(dá)。將Prl基因連接在組成型勾巢曲霉三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子下，并在Ti質(zhì)粒PROK Ⅱ上的T-DNA左右邊界之間插入bar基因和Prl基因組成型表達(dá)框，轉(zhuǎn)化出發(fā)菌株為國(guó)家產(chǎn)業(yè)化示范菌株布氏白僵菌1019，實(shí)現(xiàn)prl蛋白酶基因的在其染色體上的整合。在非誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的酶活測(cè)定結(jié)果表明，重組菌株的比酶活約為15U mg<-1>蛋白，實(shí)現(xiàn)了類枯草桿菌蛋白酶Prl的組成型表達(dá)。同時(shí)在蟬蛻誘導(dǎo)培