平菇遺傳轉(zhuǎn)化體系和轉(zhuǎn)漆酶工程菌株的構(gòu)建.pdf

1、我國(guó)每年僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘?jiān)?麥秸、玉米秸稈)等就約6億t,其富含木質(zhì)纖維素。應(yīng)用食用菌轉(zhuǎn)化秸稈、變廢為寶是一條成功的途徑。為提高食用菌利用木質(zhì)纖維素的能力,提高食用菌對(duì)秸稈的生物學(xué)效率,本文以平菇天達(dá)300為材料,構(gòu)建了高效遺傳表達(dá)體系,并進(jìn)行了漆酶基因轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果如下:
　　 (1)平菇sdi啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)載體25號(hào)的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化克隆了平菇天達(dá)300的同源啟動(dòng)子-1.3kb的sdi啟動(dòng)子,利用重疊PCR將sdi啟

2、動(dòng)子片段和潮霉素抗性基因hph融合,構(gòu)建了以pMD19-T載體為骨架,含有sdi啟動(dòng)子和hph以及CaMV終止子的表達(dá)載體25號(hào)。
　　 以液體培養(yǎng)的平菇菌絲為實(shí)驗(yàn)材料,0.6mol/L甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑,濃度為1.6％的溶壁酶溶液,30℃酶解3h,獲得具有再生活力的原生質(zhì)體。平菇天達(dá)300原生質(zhì)體的得率約為5.7×106個(gè)/mL,在RCM再生平板上的再生率為0.46％。
　　 通過平菇的潮霉素抗性試驗(yàn),確定了其菌絲和

3、原生質(zhì)體的潮霉素致死濃度。據(jù)此將轉(zhuǎn)化的初篩濃度定為80μg/mL,復(fù)篩濃度定為100μg/mL。采用PEG—CaCl2介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法,將表達(dá)載體25號(hào)轉(zhuǎn)化入平菇,在含80μg/mL潮霉素RCM平板上,獲得一系列轉(zhuǎn)化子。這些轉(zhuǎn)化子經(jīng)過復(fù)篩和PCR鑒定后得到潮霉素抗性基因hph整合入宿主基因組的陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行表型和RNA轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證,表明hph基因整合入平菇的基因組,其抗性可以穩(wěn)定的遺傳和表達(dá),從而建立了平菇的遺傳

4、轉(zhuǎn)化體系。
　　 (2)食用菌不同轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率的比較將兩個(gè)含有潮霉素抗性基因但啟動(dòng)子不同的真菌表達(dá)質(zhì)粒pAN7-1和PBHt1,導(dǎo)入平菇中與25號(hào)做比較表明,不同的啟動(dòng)子得到的抗性轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速率、轉(zhuǎn)化率、RNA水平上的轉(zhuǎn)錄都不同。pAN7—1抗性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化率最高,0.4個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA,其hph目的基因的表達(dá)量最大；其次是25號(hào)抗性質(zhì)粒,0.2個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA；PBHt1的表達(dá)量較少。
　　 (3)平

5、菇漆酶基因poxc的克隆和同源表達(dá)利用RT-PCR和LAPCR步行等技術(shù)從平菇天達(dá)300中獲得編碼漆酶基因poxc的gDNA和cDNA。gDNA全長(zhǎng)為3818bp,包含19個(gè)內(nèi)含子和20個(gè)外顯子。cDNM序列全長(zhǎng)為1607bp,編碼533個(gè)氨基酸的蛋白,與其它真菌漆酶蛋白序列有較高的同源性,并且含有3個(gè)真菌類Cu-oxidase的高度保守結(jié)構(gòu)域。
　　 構(gòu)建了含有sdi啟動(dòng)子和poxc基因的同源表達(dá)載體PIPOXC和PI2POX