枯草芽孢桿菌脂肽化合物合成調控基因功能研究及多功能生防工程菌株的構建.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有生長速度快，代謝產物豐富，利用開發(fā)價值高以及食用安全等顯著優(yōu)點，廣泛應用于農業(yè)生物防治。研究枯草芽孢桿菌快速分子鑒定方法以獲得更多具有應用價值的新菌株具有重要意義. 采用16S rDNA序列分析法對本實驗室采用傳統(tǒng)方法鑒定的枯草芽孢桿菌菌株B3、38、43、49、55、85進行鑒定結果表明：測定的芽孢桿菌菌株與己報道的枯草芽孢桿菌屬具有高度的同源性，其中B3、38、43、49

2、、55、85菌株的16S rDNA與模式菌株168的同源性分別為99.4％、99.5％、99.7％、93.8％、96.8％和99.4％。B3的16S rDNA序列已經登錄到了GenBank上，登錄號為：EF492885。應用DNAstar軟件對這些序列進行分析，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，B3、38、43、49、55、85與枯草芽孢桿菌模式菌株168聚在一起，說明它們的親緣關系較近. 基質協助激光解吸附/電離-飛行時間質譜(matrix-

3、assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術是近年來發(fā)展起來的新的質譜離子化技術，通過對細菌成分的分析，來鑒定細菌的類別。為快速準確鑒定枯草芽孢桿菌，本研究采用MALDI-TOF-MS對本實驗室分離保存的枯草芽孢桿菌菌株B3、38、43、49、55、85進行分析，以來自美國菌種保藏中心菌株168、ATCC6633

4、、ATCC13952、ATCC21332，及柏林理工大學Dr.Joahim Vater惠贈的菌株A1/3、b213、Cl為標準菌株.分析結果表明，枯草芽孢桿菌菌株一般出現3-4條譜帶，其中m/z為379、493、618、714、843和969是經常和比較穩(wěn)定出現的特征性信號譜帶. 我們對上述鑒定的枯草芽孢桿菌進行了油菜菌核病菌和水稻白葉枯病菌的平板抑菌實驗.結果表明，菌株B3、38、43、49、55和85對油菜菌核病菌具有顯著的

5、抑制菌絲生長的作用，MALDI-TOF檢測表明，這些菌株能夠產生抑制真菌的脂肽化合物fengycin和iturin family(Bacillomycins D、Iturin和Mycosubtilins).而38、43、55和85還對水稻白葉枯病菌具有顯著抑制作用，可以用這些菌株能夠產生具有抑制細菌活性的脂肽化合物surfactin來解釋. 為了提高枯草芽孢桿菌脂肽活性物質的產量，對脂肽化合物合成調控區(qū)的兩個未知功能的基因ycx

6、D和aspB3進行了初步的研究。枯草芽孢桿菌存在十多種GntR家族轉錄調控子，參與細菌中各種不同的生物過程的調控?；蚬δ茴A測表明，ycxD基因編碼產物屬于GntR家族轉錄調控子，并具有轉氨酶的結構域。AspAT轉氨酶編碼基因也有十多個，這類酶對枯草芽孢桿菌氮和碳代謝起到非常重要的作用。基因功能預測表明，aspB3基因編碼產物具有天冬氨酸轉氨酶的功能域。為了驗證這兩個基因編碼產物是否具有轉氨酶的活性，本研究分別構建了大腸桿菌表達載體pE

7、TycxD和pETasp，并利用Ni柱純化重組蛋白.轉氨酶活性研究表明，YcxD蛋白不具有轉氨酶的功能，推YcxD蛋白可能屬于GntR轉錄調控因子家族，具體的功能有待進一步深入研究.酶活性檢測表明，AspB3蛋白屬于天冬氨酸轉氨酶家族。對AspB3蛋白的酶學性質深入研究表明，AspB3轉氨酶的最適反應溫度為40℃，最適PH值為8.2，最適底物為L-Asp.該酶的熱穩(wěn)定性強，并且金屬離子對酶反應有影響。AspB3蛋白的序列分析和系統(tǒng)發(fā)育研

8、究表明AspB3轉氨酶是新型的熱穩(wěn)定性天冬氨酸轉氨酶，屬于AspAT家族的Iα亞家族.催化活性位點的研究表明: AspB3蛋白中D232殘基的功能是固定輔酶，加強輔酶的吸電子能力和加速反應的活性；K270殘基是輔酶PLP的結合部位；R403殘基直接參與二羧基底物識別，目前，E.coli AspAT被應用于酶法生產氨基酸.例如，生成的L-苯丙氨酸(L-Phe)，但E.coli AspAT的熱穩(wěn)定性不強制約著這種酶法生產氨基酸的大規(guī)模應用，

9、相比之下AspB3轉氨酶具有熱穩(wěn)定性強、酶活性高，最適溫度偏堿的優(yōu)勢，因此AspB3轉氨酶具有應用生產L-Phe的價值. 為了向枯草芽孢桿菌中引入新的生防作用因子，本研究利用芽孢桿菌分泌表達系統(tǒng)，構建了能分泌HpaGXooc蛋白的枯草芽孢桿菌基因工程菌.HpaGXooc是由水稻細條斑菌(Xanthornonas oryzae pv. oryzicola)產生的一種非特異性蛋白激發(fā)子，屬于harpin蛋白家族.HpaGXooc能激

10、發(fā)非寄主植物的過敏性壞死，誘導植物抗蟲、抗病和抗旱，而且能促進植物生長，在本研究中，為了利用芽孢桿菌表達系統(tǒng)分泌表達HpaGXooc，構建了pMSF、pM43SF和pM43HF三個表達載體.pMSF重組載體含有HpaII組成性啟動子和nprB信號肽組件；pM43SF和pM43HF兩個重組載體都含有P43強啟動子和nprB信號肽組件，不同的是為了快速地純化分泌的重組蛋白，pM43HF分泌的HpaGXooc的C端融合了6×His tag標簽

11、.SDS-PAGE和Western blot實驗結果表明芽孢桿菌能夠分泌表達HpaGXooc蛋白.ELISA分析結果表明，B.subtilis WBSF1(pMSF)的HpaGXooc表達量低于B.subtilis WBSF2(pM43SF)和B.subtilis WBHF(pM43HF)，該實驗證明了在芽孢桿菌中HpaII啟動子活性低于P43啟動子.我們又將高效表達載體pM43HF轉入surfactin生產菌株B.subtilis O

12、KB105中，得到了基因工程菌株B.subtilisOKBHF.Western blot和ELISA檢測表明B.subtilis OKBHF的HpaGXooc表達量低于WBHF.ELISA測定了B.subtilis WBHF分泌HpaGXooc的最佳培養(yǎng)條件，B.subtilisWBHF分泌的HpaGXooc的生物學功能的測定表明：該重組蛋白能激發(fā)煙草的HR(hypersensitive response)反應，和促進煙草根系的生長.R