慢性應激誘導的青年雄性抑郁大鼠的腦蛋白質(zhì)組學研究及大黃素干預.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　第一部分 慢性應激誘導的抑郁大鼠和應激抵抗大鼠腦蛋白質(zhì)組學研究
　　目的：
　　研究慢性不可預測溫和應激（CUMS）誘導的大鼠的不同行為學表現(xiàn)及海馬內(nèi)不同變化。通過蛋白質(zhì)組學定量分析各組海馬組織，力圖發(fā)現(xiàn)與抑郁和應激抵抗相關的差異蛋白及生物過程，揭示針對應激發(fā)生不同反應的可能的分子機制。
　　方法：
　　選取8周齡的SD大鼠，每日隨機給予大鼠以下刺激中的2-3種，包括：禁

2、食（24 h）、禁水（24 h），群居（每4-5只飼養(yǎng)在一個小鼠籠內(nèi)，12 h）、傾斜鼠籠（16 h）、鼠籠環(huán)境潮濕（將200 ml的水倒入鼠籠）、白噪音刺激（85 dB，6 h）、空瓶子（2 h）、熱刺激（45 oC，15 min）、冷刺激（4 oC，2 h）、持續(xù)光照（12 h）和閃光燈刺激（200 Hz，4 h），持續(xù)7周。刺激前后均用糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、曠場實驗評價大鼠的行為狀態(tài)。根據(jù)行為學表現(xiàn)，應激后分為三組，正常對照

3、組、應激抵抗組、應激敏感組（即抑郁組）。采用尼氏染色和高爾基染色分別檢測海馬神經(jīng)元的數(shù)目和海馬神經(jīng)元的樹突棘。通過免疫組化方法研究小膠質(zhì)細胞的形態(tài)，并進行體視學分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定海馬內(nèi)促炎因子的水平。檢測海馬組織脂質(zhì)氧化指標（丙二醛）和抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的水平和活性。采用基于 iTRAQ技術的蛋白質(zhì)組學定量分析各組海馬組織，篩選出差異表達蛋白；對差異蛋白進行生物學分析：GO注釋及GO富集分析，尋找與差異表

4、達蛋白顯著相關的生物學過程。然后采用免疫印跡、免疫組織化學、免疫熒光的方法對相關蛋白及生物學過程進行驗證及進一步深入研究。
　　結果：
　　1.抑郁組的大鼠糖水消耗百分比下降到45％，而對照組和應激抵抗組仍為80%以上；抑郁組的大鼠在水中靜止不動的時間為220 s，明顯高于對照組的78 s和應激抵抗組的82 s；抑郁組大鼠5 min內(nèi)穿越的格子數(shù)目約30個，這明顯低于對照組的149個和應激抵抗組的138個，抑郁組大鼠的雙上肢

5、垂直上抬的次數(shù)下降至8次，少于對照組的27和應激抵抗組的26；以上結果，抑郁組大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為，但是應激抵抗組大鼠并未表現(xiàn)出抑郁樣行為。
　　2.尼氏染色結果顯示抑郁組海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元面積較對照組均下降30%左右，而應激抵抗組與對照組相比沒有差異。海馬樹突棘研究結果顯示，抑郁組大鼠海馬CA1區(qū)的樹突棘和成熟的蘑菇型樹突棘分別為4.3個/10μm、1.7個/50μm，對照組的分別為10.7個/10μm、6.

6、7個/50μm，應激抵抗組分別為10個/10μm、6.3個/50μm，表明抑郁組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目及其樹突棘數(shù)目下降，應激抵抗組沒有發(fā)生神經(jīng)元及其樹突棘的丟失。
　　3.小膠質(zhì)細胞形態(tài)學研究結果顯示，抑郁組海馬區(qū)三種狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞所占百分比分別為靜息態(tài)16.4%、中間態(tài)35.2%、激活態(tài)48.4%，對照組則分別為靜息態(tài)68.7%、中間態(tài)24.3%、激活態(tài)7%，而應激抵抗組為靜息態(tài)45.2%、中間態(tài)45.8%、激活態(tài)9%。抑郁組海

7、馬區(qū)處于激活態(tài)的小膠質(zhì)細胞高于另外兩組，而應激抵抗組的海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞更多的是處于中間態(tài)。
　　4. ELISA結果顯示，對照組海馬IL-1β、TNF-α的水平分別為50.8 pg/mg蛋白，26.2 pg/mg蛋白，應激抵抗組分別為48.7 pg/mg蛋白，24.1 pg/mg蛋白，抑郁組分別為108.4 pg/mg蛋白，56.4 pg/mg蛋白，明顯高于對照組和應激抵抗組。
　　5.氧化應激指標檢測結果顯示，對照組海馬丙

8、二醛的水平為0.41 nmol/mg蛋白，應激抵抗組為0.37 nmol/mg蛋白，抑郁組為0.76 nmol/mg蛋白，明顯高于對照組和應激抵抗組；對照組海馬超氧化物歧化酶的活性為100.8 U/mg蛋白，應激抵抗組為151.2 U/mg蛋白，高于對照組，抑郁組為62.5 U/mg蛋白，明顯低于對照組和應激抵抗組。
　　結論：
　　CUMS后，抑郁組的大鼠海馬內(nèi)許多蛋白水平發(fā)生異常變化，這些蛋白的異常變化可能介導了突觸可塑

9、性、炎癥過程、氧化應激、信號通路、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等相關生物學過程的異常，使海馬內(nèi)出現(xiàn)顯著的炎癥反應、氧化應激反應，從而導致海馬神經(jīng)元數(shù)目及其樹突棘數(shù)目下降、星形膠質(zhì)細胞可塑性降低等，最終引起抑郁樣行為的發(fā)生。CUMS后，應激抵抗的大鼠海馬內(nèi)同樣存在一些蛋白水平發(fā)生變化，這些蛋白可能參與了一系列的生物過程的調(diào)控，比如增強氧化磷酸化作用及抗氧化應激能力，使得星形膠質(zhì)細胞可塑性增強，炎癥反應受到抑制，神經(jīng)元未發(fā)生異常病變，從而成功抵制了抑郁樣行為的

10、發(fā)生。
　　第二部分 大黃素改善抑郁的腦保護機制
　　目的：
　　研究大黃素對于慢性不可預測溫和應激誘導的抑郁樣行為的治療作用，并探索其作用機制。
　　方法：
　　采用CUMS制造抑郁模型，5周后通過糖水偏好實驗篩選出有抑郁傾向的大鼠，然后給予大黃素灌胃治療兩周，每日劑量為80 mg/kg，給藥的過程中應激同前，兩周之后，對各組大鼠進行行為學檢測，評價其抑郁狀態(tài)。采用尼氏染色檢測海馬神經(jīng)元，采用高爾基染色檢

11、測海馬神經(jīng)元的樹突棘。通過免疫組化檢測小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化，并進行體視學分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定海馬內(nèi)促炎因子的水平，檢測海馬組織脂質(zhì)氧化指標MDA和抗氧化酶（SOD）的水平和活性。采用免疫印跡、免疫組化、免疫熒光實驗，檢測 Nrf2及其磷酸化水平變化，檢測 GSK3β，PI3K/AKT的變化，檢測5-LO的水平變化。采用熒光定量 PCR的方法檢測 miR495，miR139-5p， miR135-5p，miR126-3p的水平變

12、化。
　　結果：
　　1.大黃素干預的抑郁傾向組糖水消耗百分比為78.5%，較載體干預的抑郁傾向組明顯升高，且與正常對照組相比沒有差異。大黃素干預的抑郁傾向組在水中靜止不動的時間為79 s，明顯低于載體干預的抑郁傾向組的206 s，且與正常對照組相比沒有差異。大黃素干預的抑郁傾向組大鼠5 min內(nèi)穿越的格子數(shù)目約124個，這明顯高于載體干預的抑郁傾向組25個，且與正常對照組相比沒有差異；同時大黃素干預的抑郁傾向組大鼠的雙上肢

13、垂直上抬的次數(shù)為約22次，這明顯高于載體干預的抑郁傾向組的8次，且與正常對照組對比沒有差異。
　　2.尼氏染色結果顯示，與載體干預的抑郁傾向組相比，大黃素干預的抑郁傾向組的海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元面積分別增加了25%、19%、22%，且均與正常對照組對比無差異。高爾基染色結果顯示，大黃素干預的抑郁傾向組的海馬 CA1區(qū)的樹突棘和成熟的蘑菇型樹突棘分別為8.3個/10μm、4個/50μm，明顯高于載體干預的抑郁傾向組的4.3

14、個/10μm、2個/50μm，但仍均低于正常對照組。
　　3.小膠質(zhì)細胞形態(tài)學研究結果顯示，載體干預的抑郁傾向組海馬區(qū)三種狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞所占百分比分別為靜息態(tài)16.4%、中間態(tài)35.2%、激活態(tài)48.4%，而大黃素干預的抑郁傾向組的分別為靜息態(tài)56.6%、中間態(tài)28.8%、激活態(tài)14.6%，可見大黃素干預后可明顯升高靜息態(tài)的比例和降低激活態(tài)的比例，但其中間態(tài)的比例仍高于正常對照組。
　　4. ELISA結果顯示，載體干預的

15、抑郁傾向組海馬 IL-1β、TNF-α的水平分別為110.1 pg/mg蛋白，55.1 pg/mg蛋白，而大黃素將其分別降低到60.5 pg/mg蛋白、32.9 pg/mg蛋白，這表明大黃素可以明顯降低慢性應激誘導的海馬炎癥因子水平的升高。氧化應激指標顯示，大黃素干預的抑郁傾向組的海馬組織的 MDA水平為0.39 nmol/mg蛋白，SOD活性為90.7 U/mg蛋白，而載體干預的抑郁傾向組分別為0.73 nmol/mg蛋白，61.2

16、U/mg蛋白，表明大黃素可以有效改善氧化與抗氧化之間的失衡。
　　5.免疫印跡實驗結果表明，與載體干預的抑郁傾向組相比，大黃素干預的抑郁傾向組海馬全細胞p-Nrf2水平升高了157%，且比正常對照組也升高了100%。成分蛋白實驗結果提示，正常情況下，t-Nrf2在細胞漿和細胞核中均有分布，而p-Nrf2幾乎全部分布在細胞核中。慢性應激后，載體干預的抑郁傾向組海馬組織的細胞漿內(nèi)的t-Nrf2水平升高，細胞核內(nèi)的t-Nrf2水平降低，

17、而大黃素干預后可使細胞漿和細胞核內(nèi)的t-Nrf2均恢復到正常水平，同時p-Nrf2在載體干預的抑郁傾向組細胞核內(nèi)水平明顯下降，而大黃素干預后，不僅可以增加細胞核內(nèi)p-Nrf2水平，且高于正常對照組。同時，腦片免疫組化染色結果顯示，大黃素干預后p-Nrf2在海馬CA1，CA3，DG區(qū)的表達量增加，其中 CA1區(qū)增加最為明顯，且高于正常對照組。免疫熒光雙標實驗結果顯示，p-Nrf2主要分布在神經(jīng)元內(nèi)，大黃素干預的抑郁傾向組較載體干預的抑郁傾

18、向組海馬CA1，CA3，DG區(qū)表達明顯增加，且?guī)缀跞糠植技毎藘?nèi)。
　　結論：
　　大黃素可以通過激活PI3K/AKT信號通路抑制應激后GSK3β的過度激活，進而促進 Nrf2能發(fā)揮正常的抗氧化應激作用，同時大黃素還可以通過上調(diào) miR495和miR139-5p來逆轉(zhuǎn)慢性應激誘導的5-LO活性和水平升高，進而抑制應激后的炎癥反應?？傊簏S素可以通過對異常的氧化應激反應和炎癥反應的抑制，顯著改善海馬神經(jīng)元及其樹突棘的丟失，