人類肽鏈釋放因子eRF3與生存素survivin的相互作用研究.pdf

1、真核生物的蛋白質(zhì)合成終止需要兩種相互作用的釋放因子，第一類肽鏈釋放因子(eukaryotic release factor1，eRF1)和第二類肽鏈釋放因子(eukaryotic release factor3，eRF3)。eRF3是一種GTPase，與eRF1相互作用形成復(fù)合體，確?？焖儆行У碾逆溼尫?。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)eRF3是一種多功能蛋白質(zhì)，還參與了細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞骨架組裝和腫瘤發(fā)生等過程。哺乳動(dòng)物中eRF3有兩種，分別為eRF3

2、a和eRF3b，兩者的區(qū)別在于其N末端結(jié)構(gòu)域有差異。eRF3a有三種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，異構(gòu)體1（eRF3a-F1）和2(eRF3a-F2)只有一個(gè)氨基酸不同，而異構(gòu)體3(eRF3a-F3)的N末端卻缺失了約140個(gè)氨基酸。生存素survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis，IAP）家族的最小成員,該蛋白結(jié)構(gòu)獨(dú)特，功能多樣，在多種人的腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并在細(xì)胞分裂，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)以及細(xì)胞凋亡等途徑中起顯著作用，因此

3、倍受關(guān)注。eRF3和survivin的功能都與細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生相關(guān)，它們是否協(xié)同作用參與了這些過程的調(diào)控是一個(gè)值得探究的問題。本研究利用酵母雙雜交和pull down分析證實(shí)了人類eRF3a-F3、eRF3b與survivin的相互作用關(guān)系，并確定了其相互作用的結(jié)構(gòu)域，還對(duì)兩者進(jìn)行了亞細(xì)胞共定位分析，為進(jìn)一步探討細(xì)胞有絲分裂調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。
　　本研究從人的宮頸癌細(xì)胞中克隆獲得了survivin cDNA，利用本實(shí)驗(yàn)

4、室已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-heRF1和已克隆的人類eRF3a-F3和eRF3b cDNA構(gòu)建了一系列酵母雙雜交重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，經(jīng)SD-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基嚴(yán)謹(jǐn)篩選后，進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)survivin/eRF3a-F3和survivin/eRF3b的酵母菌均顯示藍(lán)色，與陽(yáng)性對(duì)照組(表達(dá)eRF1/eRF3a-F3和eRF1/eRF3b)的結(jié)果一致，而陰性對(duì)照組（

5、只表達(dá)survivin、eRF3a-F3和eRF3b）未顯示藍(lán)色。結(jié)果表明eRF3a-F3和eRF3b均能與survivin相互作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證eRF3和survivin在體外的作用關(guān)系，構(gòu)建了一系列原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。分別利用GST及Ni-NTA親和層析純化GST融合蛋白和His融合蛋白，用于pull down實(shí)驗(yàn)。將His-eRF3a-F3表達(dá)上清與結(jié)合有純化的GST-hSVV的G

6、S4B介質(zhì)結(jié)合后，洗去雜蛋白，洗脫產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后，用抗His的抗體經(jīng)western blotting進(jìn)一步鑒定，結(jié)果為陽(yáng)性。另外，將GST-heRF3b表達(dá)上清與結(jié)合有純化的His-hSVV的Ni-NTA介質(zhì)相結(jié)合，洗去非特異蛋白后，洗脫產(chǎn)物同樣經(jīng)SDS-PAGE分析并用抗GST的抗體經(jīng)westernblotting進(jìn)一步鑒定，結(jié)果也呈陽(yáng)性。這說明eRF3a-F3、eRF3b和survivin在體外也能相互作用。
　

7、　本研究確定了eRF3和survivin相互作用的最小結(jié)構(gòu)域。分別對(duì)eRF3a-F3、eRF3b和survivin進(jìn)行了截短突變，共構(gòu)建了7個(gè)重組質(zhì)粒:pGADT7-heRF3a-F3△1-72、pGADT7-heRF3b△1-201和pGBKT7-hSVV△1-88、pGBKT7-hSVV△1-44、pGBKT7-hSVV△1-64、pGBKT7-hSVV△1-76、pGBKT7-hSVV△77-142。酵母雙雜交結(jié)果表明eRF3與s

8、urvivin的相互作用結(jié)構(gòu)域位于eRF3a-F3的1-72位氨基酸，eRF3b的131-200位氨基酸。而eRF3a-F3的1-72位氨基酸相當(dāng)于eRF3a-F1的139-210位氨基酸和eRF3b的130-201位氨基酸，說明該區(qū)域是兩種蛋白質(zhì)相互作用必需的。結(jié)果還表明survivin的65-76位氨基酸是survivin與eRF3相互作用必需的結(jié)構(gòu)域，其中的68EPDDD72可形成一個(gè)帶負(fù)電荷的β折疊。為了研究eRF3和survi

9、vin相互作用是否參與細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的調(diào)控，構(gòu)建了融合綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)的重組表達(dá)載體pEGFP-N1-heRF3a-F3、pEGFP-N1-heRF3b和pDsRed2-N1-hSVV，共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)GFP-eRF3a-F3和GFP-eRF3b導(dǎo)致綠色熒光蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累;同時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)還有RFP-survivin表達(dá)的紅色熒光蛋白的分布。eRF3和survivin