真核肽鏈釋放因子3b(eRF3b)多克隆抗體制備及其在HBV感染肝硬化中診斷價值的初步研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球面臨的一項(xiàng)重大公共衛(wèi)生問題，據(jù)WHO估計(jì)，全球約有20億人感染了HBV，有3.6億人成為慢性乙肝患者。HBV感染者中大約有15-40％的人會發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭、肝細(xì)胞癌(HCC)。HBV感染、肝硬化是HCC最主要的危險(xiǎn)因素，但是從慢性乙型肝炎、肝硬化發(fā)展為肝癌需要經(jīng)過很多年，如果能對這些高危人群進(jìn)行定期監(jiān)測，早期發(fā)現(xiàn)、診斷，就能及時進(jìn)行治療，從而延長患者壽命。但是由于現(xiàn)有的診斷技術(shù)包括一些血清

2、標(biāo)志物其早期診斷效果不佳，靈敏度、特異度不高，從而造成了病情的延誤，因此需要尋找更為靈敏的，診斷準(zhǔn)確度更高的標(biāo)志物，為臨床決策提供幫助。
　　 本室前期通過乙肝及其相關(guān)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，利用飛行質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一個多肽片段4210Da，在慢性乙肝及其相關(guān)疾病不同病程中的含量存在顯著性差異。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，4210Da是真核肽鏈釋放因子eRF3b裂解后的一部分，因此設(shè)想eRF3b蛋白在乙肝及其相關(guān)疾病中是否也存在差異。
　　

3、 由于目前市場上沒有eRF3b蛋白含量檢測試劑盒，因此本研究自行制備了針對eRF3b氨基端第108-215位氨基酸的兔多克隆抗體和大鼠多克隆抗體，由于這段多肽含有110個氨基酸，因此稱其為eRF3b-110，編碼eRF3b的基因?yàn)镚SPT2，eRF3b-110所對應(yīng)的基因片斷記為GSPT2-330。通過雙抗體夾心ELISA檢測血清中eRF3b的含量，分析eRF3b在乙肝及其相關(guān)疾病中的診斷價值，為臨床大規(guī)模的病例對照研究奠定基礎(chǔ)。

4、>　　 方法：
　　 (1)分子克隆GSPT2-330基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒。采用胍鹽酸法提取基因組DNA，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得GSPT2-330。將GSPT2-330基因克隆至pGEX-4t-1載體中，并應(yīng)用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行重組質(zhì)粒PCR鑒定及測序分析。
　　 (2)融合蛋白的表達(dá)、純化、酶切。對含有pGEX-4t-1-GSPT2-330重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH.5α進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得帶有GS

5、T標(biāo)簽的GST-eRF3b-110融合蛋白，通過10％SDS-PAGE檢測融合蛋白表達(dá)及可溶性。大量表達(dá)GST-eRF3b-110融合蛋白，通過GST SefinoseTM Resin純化帶有GST標(biāo)簽的GST-eRF3b-110融合蛋白，進(jìn)行10％SDS-PAGE檢測GST-eRF3b-110融合蛋白純化情況。通過凝血酶在GST SefinoseTM Resin柱上酶切GST-eRF3b-110融合蛋白，進(jìn)行18％SDS-PAGE檢測

6、GST-eRF3b-110融合蛋白酶切情況。對酶切獲得的eRF3b-110蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
　　 (3)多克隆抗體的制備和純化。用酶切后的eRF3b-110作為抗原免疫新西蘭大白兔，用GST-eRF3b-110融合蛋白作為抗原免疫Wistar大鼠，制備多克隆抗體。采用間接ELISA法測定抗體效價，并通過western blot檢測抗體特異性。采用protein A親和層析柱進(jìn)行抗體純化，純化后的抗體用間接ELISA進(jìn)行抗體效價

7、的測定，通過SDS-PAGE分析抗體的純度，并測定抗體濃度。
　　 (4)建立雙抗夾心ELISA法，檢測病人血清中eRF3b含量。以兔抗人eRF3b多克隆抗體作為包被抗體，以大鼠抗人GST-eRF3b多克隆抗體作為檢測抗體，通過方陣滴定法確定最佳試驗(yàn)條件，建立雙抗體夾心ELISA體系。測定正常對照、慢性乙肝患者、HBV感染肝硬化患者、HBV感染肝癌患者血清中eRF3b含量。
　　 (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用SPSS17.0進(jìn)

8、行統(tǒng)計(jì)分析，對于計(jì)量資料而言，正態(tài)分布的資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示；非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）即M(P25，P75)表示。對于計(jì)量資料的比較，如果數(shù)據(jù)滿足獨(dú)立性、正態(tài)性、方差齊性則采用方差分析，否則采用秩和檢驗(yàn)。以p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制ROC曲線，尋找最佳臨界點(diǎn)，進(jìn)而確定靈敏度和特異度等衡量診斷準(zhǔn)確性的指標(biāo)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)目的片段的分子克隆、重組質(zhì)粒的構(gòu)建。采用胍鹽

9、酸法提取了基因組DNA，并以此為模板成功克隆出了GSPT2-330基因。構(gòu)建了pGEX-4t-1-GSPT2-330重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH.5α內(nèi)。
　　 (2)融合蛋白的表達(dá)、純化和酶切。含重組質(zhì)粒的DH.5α經(jīng)1.0mM IPTG誘導(dǎo)后在50KDa左右的位置出現(xiàn)一新蛋白條帶，并且為可溶性蛋白，存在于裂解液上清中。對融合蛋白采用GST SefinoseTM Resin親和層析柱純化，純化后的蛋白在50KDa左右的位

10、置，與蛋白表達(dá)出的位置一致。凝血酶酶切GST-eRF3b-110融合蛋白后，通過電泳發(fā)現(xiàn)，原來位于50KDa左右的GST-eRF3b-110融合蛋白被切成了24KDa左右的eRF3b-110蛋白和26KDa左右的GST蛋白。對電泳分離的eRF3b-110條帶切膠回收進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示目的條帶與eRF3b-110蛋白的氨基酸序列匹配，證實(shí)了目的條帶確實(shí)為eRF3b-110蛋白。
　　 (3)多克隆抗體的檢測。對制備的多克隆抗體

11、進(jìn)行效價測定，結(jié)果顯示兔多克隆抗體效價為1:384，000，大鼠多克隆抗體效價為1:51，200。對克隆的GST-eRF3b-110、eRF3b-110、GST蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，當(dāng)兔多抗按1:5000稀釋時，Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃描硝酸纖維素膜(NC膜)的結(jié)果顯示，在50KDa左右的位置可見GST-eRF3b-110融合蛋白的條帶，在24KDa左右的位置可見eRF3b-110的條帶，而GST條帶在膜上未見；

12、當(dāng)大鼠多抗按1:500稀釋時，掃膜的結(jié)果顯示，在50KDa左右的位置可見GST-eRF3b-110融合蛋白的條帶，在24KDa左右的位置可見eRF3b-110的條帶，在26KDa左右的位置可見GST條帶。對HepG2細(xì)胞中eRF3b蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，無論是兔多抗還是大鼠多抗，在NC膜上均可見eRF3b單一蛋白條帶。
　　 (4)多克隆抗體純化的結(jié)果。抗體經(jīng)過protein A親和層析柱純化后，兔多抗效價為1:

13、192，000，大鼠多抗效價為1:25，600。純化后的抗體進(jìn)行12％SDS-PAGE，結(jié)果可見在50KDa左右的位置有一條IgG重鏈條帶，在25KDa左右的位置有一條IgG輕鏈條帶。經(jīng)BCA總蛋白定量試劑盒定量，純化后的兔多抗?jié)舛葹?.2mg/ml，純化后的大鼠多抗?jié)舛葹?.8mg/ml。
　　 (5)雙抗體夾心ELISA法的建立及病人血清中eRF3b含量的檢測。包被抗體為兔抗eRF3b多克隆抗體，最適包被濃度為4μg/ml;

14、檢測抗體為大鼠抗GST-eRF3b多克隆抗體，最適檢測濃度為4μg/ml;酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的羊抗大鼠IgG，最適稀釋比為1:2000。通過繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定檢測最低陽性界值為3.9ng/ml。測定49例正常對照(control)、36例CHB患者、34例HBV-Cirr患者、30例HBV-HCC患者血清中eRF3b含量。結(jié)果顯示，HBV-Cirr患者血清中eRF3b濃度的中位數(shù)為5.79ng/ml，顯著高于control、CHB

15、、HBV-HCC組(p值均小于0.007)，control組eRF3b濃度的中位數(shù)為1.50ng/ml，CHB組中位數(shù)為1.09ng/ml，HBV-HCC組中位數(shù)為2.10ng/ml，這三組之間血清中eRF3b濃度無顯著性差異?；赗OC曲線分析，區(qū)分肝硬化和非肝硬化（包括正常對照、慢性乙肝、肝癌）的最適臨界值為3.84ng/ml，在此濃度時，診斷試驗(yàn)的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度分別為70.6％、73.9％和73.2％；區(qū)分肝硬化和其它乙肝

16、相關(guān)性疾?。ò砸腋巍⒏伟┑淖钸m臨界值為2.82ng/ml，在此濃度時，診斷試驗(yàn)的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度分別為76.5％、68.2％和71.0％。
　　 結(jié)論：
　　 (1)克隆出GSPT2-330基因，并構(gòu)建了pGEX-4t-1-GSPT2-330重組質(zhì)粒。
　　 (2)表達(dá)、純化出GST-eRF3b-110融合蛋白，凝血酶酶切獲得eRF3b-ll0蛋白。
　　 (3)制備并純化了兔抗人eRF3b