人mRNA輸出因子Gle1與肽鏈釋放因子相互作用的分析.pdf

1、特定mRNA的輸出、轉(zhuǎn)錄和翻譯是基因表達(dá)的必要前提。然而，這些連續(xù)步驟之間的功能聯(lián)系尚不清楚。在酵母及人細(xì)胞中，mRNA輸出因子Gle1對mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的輸出是必需的，有研究顯示Gle1參與釀酒酵母的蛋白質(zhì)翻譯起始和翻譯終止，并且在翻譯終止中Gle1可以直接與肽鏈釋放因子相互作用。
　　 在真核生物中，兩類肽鏈釋放因子參與蛋白質(zhì)的翻譯終止，分別是第一類肽鏈釋放因子eRF1和第二類肽鏈釋放因子eRF3。人類細(xì)胞中存在兩種

2、eRF3，分別為heRF3a、heRF3b，二者只有N末端結(jié)構(gòu)域不同。
　　 為了了解Gle1是否也參與了人的蛋白質(zhì)翻譯終止，本研究利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀證實了人Gle1蛋白與參與蛋白質(zhì)合成終止的兩類肽鏈釋放因子之間的相互作用，并初步確定了hGle1與肽鏈釋放因子相互作用的區(qū)域。同時通過免疫共定位分析了在HeLa細(xì)胞中hGle1蛋白與兩類肽鏈釋放因子的亞細(xì)胞共定位。此外，本研究檢測了hGle1的過表達(dá)對蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)翻

3、譯終止以及細(xì)胞增殖的影響。研究的主要結(jié)果如下:
　　 利用本實驗室已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBluescript-hGle1和已克隆的人類heRF1、heRF3a以及heRF3b構(gòu)建了一系列酵母雙雜交重組質(zhì)粒，并將這些重組質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109，同時設(shè)定實驗對照組，經(jīng)四缺培養(yǎng)基SD-Leu-Trp-His-Ade嚴(yán)格篩選，β-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果表明，表達(dá)hGle1/heRF1，hGle1/heRF3a或者h(yuǎn)Gle1/he

4、RF3b的酵母菌均顯示藍(lán)色，與陽性對照組(表達(dá)heRF1/heRF3a)的結(jié)果一致，而陰性對照組（只表達(dá)hGle1，heRF1，heRF3a或heRF3b）則未顯示藍(lán)色。表明hGle1與人兩類肽鏈釋放因子heRF1，heRF3a，heRF3b均相互作用。
　　 為了進(jìn)一步驗證hGle1與肽鏈釋放因子之間的相互作用，構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc-heRF1、pCMV-Tag2B-hGle1。采用免疫共沉淀的方法，在HeL

5、a細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染hGle1和兩類肽鏈釋放因子的真核表達(dá)質(zhì)粒，并設(shè)定對照組。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)lag-hGle1可以免疫共沉淀Myc-heRF1、GFP-heRF3a以及GFP-heRF3b，而在陰性對照的細(xì)胞中無法檢測出這種相互作用，證實在人細(xì)胞中hGle1與兩類肽鏈釋放因子之間的相互作用確實存在。
　　 為了了解hGle1和兩類肽鏈釋放因子在細(xì)胞內(nèi)的分布，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pEGFP-N1-heRF1，將質(zhì)粒pCMV-Tag2

6、B-hGle1和pEGFP-N1-heRF1、pEGFP-N1-heRF3a或pEGFP-N1-heRF3b共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。用hGle1的特異性抗體免疫染色，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，融合有綠色熒光蛋白的heRF1、heRF3a和heRF3b大都分布在細(xì)胞質(zhì)，而紅色熒光信號所顯示的hGle1盡管在核周有大量積累，但在細(xì)胞質(zhì)中仍有分布，提示其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可能具有一定的功能。而hGle1與肽鏈釋放因子在細(xì)胞質(zhì)中的共定位也進(jìn)一步提示hGle

7、1很可能在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯終止的過程中起作用。
　　 為了探討hGle1在蛋白質(zhì)合成過程中的作用，在HeLa細(xì)胞中共轉(zhuǎn)入0.3μg海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒pRL-TK和0.1μg-0.6μgpCMV-Tag2B-hGle1或pCMV-Tag2B-GST質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48h后裂解細(xì)胞測定海腎熒光素酶的活性。結(jié)果表明，與共轉(zhuǎn)入pCMV-Tag2B-GST相比，共轉(zhuǎn)入pCMV-Tag2B-hGle1后細(xì)胞內(nèi)的海腎熒光素酶活性明顯升高，并呈現(xiàn)

8、劑量依賴關(guān)系，提示在HeLa細(xì)胞中hGle1的過表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成有促進(jìn)作用。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測hGle1過表達(dá)對蛋白質(zhì)翻譯終止的影響，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)入pCMV-Tag2B-hGle1后，HeLa細(xì)胞內(nèi)雙熒光素酶通讀率明顯降低，也呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，說明hGle1的過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯終止。
　　 利用MTT法檢測hGle1的過表達(dá)對HeLa細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)入pCMV-Tag

9、2B-hGle1的細(xì)胞增殖速率較高，這表明hGle1的過表達(dá)對細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用。
　　 本研究還初步確定了hGle1和兩類肽鏈釋放因子相互作用的結(jié)構(gòu)域。對hGle1進(jìn)行了截短突變，并構(gòu)建了3個hGle1截短體酵母雙雜交重組質(zhì)粒:pGADT7-hGle1△1-372、pGADT7-hGle1△371-659和pGADT7-hGle1△477-698。酵母雙雜交結(jié)果表明hGle1的1-372位氨基酸是其與肽鏈釋放因子相互作