游仆蟲肽鏈釋放因子eRF1對編程性翻譯移碼的影響.pdf

1、編程性翻譯移碼是mRNA翻譯為多肽鏈時(shí)核糖體沿mRNA正向或反向滑動一個(gè)/兩個(gè)堿基從而表達(dá)出蛋白的現(xiàn)象。目前為止,編程性翻譯移碼在多種病毒基因組、原生動物、酵母、鼠、人中均有報(bào)道。單細(xì)胞真核生物游仆蟲基因組中含有的編程性翻譯移碼基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他真核生物基因組。通過對游仆蟲屬已知的67個(gè)基因的分析,推測游仆蟲中>5％的基因需要發(fā)生一個(gè)或多個(gè)+1位的翻譯移碼以產(chǎn)生它們的蛋白產(chǎn)物。影響編程性翻譯移碼的因素有多種,如肽鏈釋放因子、SD相似序列、

2、假結(jié)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)、tRNA等。研究報(bào)道人的肽鏈釋放因子eRF1對HIV-1病毒的編程性-1移碼有直接的影響,而且在頻繁發(fā)生編程性+1移碼的單細(xì)胞真核生物游仆蟲中,肽鏈釋放因子eRF1對編程性翻譯移碼也有明顯的影響。
　　為了進(jìn)一步研究eRF1中影響編程性翻譯移碼的關(guān)鍵序列及調(diào)控機(jī)理,本研究構(gòu)建了在酵母中研究編程性翻譯移碼的雙熒光素酶報(bào)告檢測體系,利用游仆蟲肽鏈釋放因子Eo-eRF1b的N結(jié)構(gòu)域和酵母肽鏈釋放因子Sc eRF1的MC結(jié)

3、構(gòu)域構(gòu)建了雜合肽鏈釋放因子(Eo/Sc eRF1)及其突變體,檢測Eo-eRF1b的 N結(jié)構(gòu)域中的不同突變位點(diǎn)對移碼效率的影響。獲得以下主要結(jié)果:
　　1、首先將含有不同終止密碼子(UAA/UAG/UGA)的由七個(gè)核苷酸組成的移碼序列插入雙熒光素酶報(bào)告基因中,構(gòu)建了6個(gè)報(bào)告基因重組質(zhì)粒(pDB722A-pDB722F),同時(shí)從酵母菌株YDB447/pDB967/pDB722中篩選得到含gal啟動子調(diào)控的 eRF1的質(zhì)粒 pDB96

4、7,利用質(zhì)粒洗牌技術(shù)成功篩選獲得酵母菌株YDB447/pDB967,通過檢測不同eRF1水平下移碼序列的移碼效率,確定本研究成功建立了在酵母中研究編程性翻譯移碼的雙熒光素酶報(bào)告檢測體系。
　　2、利用游仆蟲肽鏈釋放因子Eo-eRF1b的N結(jié)構(gòu)域和酵母肽鏈釋放因子Sc eRF1的MC結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了雜合肽鏈釋放因子(Eo/Sc eRF1b),以pDB722A-pDB722F6個(gè)雙熒光素酶重組質(zhì)粒為報(bào)告基因,檢測Eo-eRF1b N結(jié)構(gòu)域

5、中的不同突變位點(diǎn)對七個(gè)核苷酸組成的移碼序列的移碼效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Eo/Sc eRF1b GT/SR突變體可以顯著提高含UAA/UAG移碼序列的移碼效率,說明eRF1保守的GT區(qū)對移碼效率有明顯的影響,當(dāng)Eo/Sc eRF1b突變體對UAA/UAG的識別增強(qiáng)時(shí),可以降低含相應(yīng)終止密碼子的移碼序列的移碼效率。另外,含I126L的組合突變體存在時(shí),含終止密碼子UAA/UAG移碼序列的移碼效率都降低了,這說明,游仆蟲中獨(dú)特的YICDNKF序

6、列可能是通過降低對終止密碼UAA/UAG的識別,從而提高了對含有UAA/UAG終止密碼子的移碼序列AAA-UAR-V(R=A或G)的移碼效率。
　　3、為了探討在雙熒光素酶中間插入大于1000 bp的移碼基因后能否利用該體系研究翻譯移碼,我們將已報(bào)道的游仆蟲移碼基因Ndr2插入到雙熒光素酶的中間,構(gòu)建了pDB722-Ndr2和pDB722-Ndr2-211報(bào)告基因重組質(zhì)粒,檢測不同的雜合eRF1突變體對移碼基因Ndr2移碼效率的影