PDX1在胃癌中的作用及啟動子CpG島甲基化與PDX1表達下調的相關性研究.pdf

1、研究背景和目的： 同源異型基因(homeobox genes)是一類包含同源框即183個氨基酸序列(homeobox)的調節(jié)基因，能夠編碼有轉錄因子功能的同源異型蛋白(homeoproteins)。同源異型基因對于胚胎逐級分化并維持自身在成年組織的表達模式有著重要作用。有些在腫瘤中表達上調的同源異型基因可能在胚胎發(fā)育中和未分化細胞中正常表達；相反，有些在腫瘤中表達下調的同源異型基因可能在成年和／或分化細胞中正常表達。目前認為同源

2、異型基因可能是正向或者負向腫瘤調節(jié)者，參與癌發(fā)生的過程。例如，CDX1和CDX2在結腸中表達缺失，但卻普遍表達于腸化組織和胃腫瘤中，與胃癌發(fā)生過程中腸分化有關。 PDX1即胰十二指腸同源異型基因(pancreatic duodenal homeobox1)，編碼胰十二指腸同源框蛋白1，又稱IPF-1、IDX-1、IUF-1。PDX1屬于ParaHox家族轉錄因子的一員，位于染色體13q12.1上，鄰近于CDX2。已知PDX1在胰

3、腺，十二指腸及胃竇的發(fā)育分化過程中起著重要作用。目前已知PDX1基因在遠端胃的內分泌細胞中有表達，其異常表達可能與胃的病理過程如胃粘膜萎縮和化生有關。但PDX1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能尚不明了。由此我們假設PDX1可能是胃癌發(fā)生發(fā)展中的潛在腫瘤調節(jié)因子。 本部分研究中，我們旨在闡明PDX1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達模式，通過體內外研究揭示PDX1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能和作用。 材料與方法： 1.實驗對象

4、7株人胃癌細胞購自American Type Culture Collection和取自香港瑪麗醫(yī)院內科系實驗室；人胃癌組織標本取自中山大學附屬第一醫(yī)院；雌性BALB／c-nu／nu裸鼠購自香港大學動物中心。 結果： 1.PDX1在胃癌組織和細胞株中的表達下調或缺失7株胃癌細胞N87、SGC7901、AGS、BCG823、KATOⅢ、 MKN45、SNU1僅有低表達或不表達PDX1；PDX1正常表達于慢性胃炎及癌旁正常組

5、織，但在74％(29／39例)的胃癌組織檢測不到(p<0.05)；PDX1 mRNA在胃癌組織中的表達顯著低于癌旁組織(p<0.05)。 　　2.PDX1和Ki-67的表達呈負相關免疫組化顯示Ki-67蛋白表達水平在癌旁組織和胃癌組織中逐漸升高，而相應地PDX1表達水平而逐漸下降，兩者有一定負相關(r=-0.771，p<0.05)。 3.PDX1過表達抑制人胃癌細胞增殖并誘導凋亡與空質粒對照比較，轉染PDX1的胃癌細胞增殖指數(shù)

6、顯著下降，同時凋亡指數(shù)明顯升高(p<0.05)；此外Ki-67表達水平升高，凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9和caspase-10的活性則被激活。 4.PDX1過表達抑制人胃癌細胞克隆形成，傷口愈合和遷移等能力與空質粒對照比較，轉染PDX1的胃癌細胞形成的單細胞克隆數(shù)明顯減少(82±14 × 103 vs 257±67 × 103，p<0.05)；其愈合傷口的速度明顯延緩，6h， 12h，2

7、4h時間點的傷口愈合率顯著降低(10％±0 vs 46.67％±3.33％，21.67％±4.41％ vs76.67％±3.33％，66.67％±8.82％ vs 93.33％±3.33％，p<0.05)；細胞遷移能力亦明顯受到抑制0(0.060±0.001 vs 0.274±0.068，p<0.05)。 5.PDX1穩(wěn)定過表達抑制胃癌細胞的體內成瘤能力接種了SGC-PDX1.6細胞的裸鼠形成的移植瘤全部消失，而接種SGC-pc

8、DNA細胞的裸鼠僅有一個瘤體消失；接種了AGS-PDX1細胞的裸鼠形成的移植瘤體積明顯小于對照組(51.6±19.5 mm3 vs 125.7±16.3 mm3，p<0.05)。 結論： 1.PDX1在胃癌中是一個抑癌基因； 2.PDX1在胃癌組織和細胞中表達下調甚至缺失； 3.PDX1與Ki-67在胃癌組織和細胞中的表達呈負向關系； 4.體外PDX1瞬時過表達能抑制胃癌細胞增殖并誘導凋亡；

9、 5.體外PDX1穩(wěn)定過表達抑制胃癌細胞克隆形成、傷口愈合及遷移能力； 6.體內實驗表明PDX1穩(wěn)定過表達抑制了裸鼠移植瘤的形成和生長． 胃癌研究背景和目的DNA甲基化是一類不改變DNA序列且能遺傳下去的化學修飾。已知啟動子CpG島的DNA甲基化能抑制下游基因的轉錄。目前明確的是啟動子CpG島胞嘧啶甲基化與基因沉默以及癌發(fā)生有關。例如PALB2、，DFNA5、NPTX2、，p16、p19、，9p21基因往往都存在CpG

10、島甲基化。 近來，研究發(fā)現(xiàn)CpG島的甲基化，尤其啟動子區(qū)域高甲基化與同源異型基因的功能沉默有關。多個研究報道HOXA10、HoxA5和HoxB5、HOXD1、HOXA9和HOXB5、ALX4、PROX1基因存在異常的DNA甲基化，從而引起這些基因表達下調或缺失。另外ParaHox家族的腸特異性同源異型基因CDX1和CDX2亦存在啟動子CpG島甲基化，且與二者在結腸癌，食道癌以及胃癌中的表達下降有關。 我們第一部分研究證實

11、了PDX1是一新的抑癌基因，在胃癌組織和細胞株中表達明顯下調，能夠抑制胃癌的增殖生長，克隆形成，細胞遷移等能力。但是PDX1在胃癌中表達缺失是否與其啟動子CpG島甲基化有關尚未明了。 本研究旨在確定PDX1可能的啟動子區(qū)域，以及分析CpG島在啟動子區(qū)域的分布情況及評價CpG島在胃癌細胞株和胃癌組織中的甲基化狀態(tài)，闡明PDX1基因在胃癌中的表達變化與啟動子CpG島甲基化的關系。 結果： 1.5’-AZA去甲基化促進

12、PDX1基因在人胃癌細胞株中的表達與對照比較，經(jīng)過5'-AZA去甲基化處理后的胃癌細胞(AGS，BCG823，SGC7901，TMK1，SNU1，MKN45)內PDX1 mRNA得到重新表達。而且5'-AZA去甲基化處理后的AGS和／或SGC7901表達的PDX1 mRNA有一定的劑量依賴性及時間依賴性。 2.PDX1啟動子報告基因活性檢測與空載體pGL3-basic轉染細胞相比，F(xiàn)383-I1和F314-I2兩段報告基因載體轉

13、染的細胞均有PDX1啟動子活性，但F383-I1表現(xiàn)出最強的啟動子活性，有最高的Firefly Luc／Renilla Luc比值。F283-I3和F724-I4轉染的細胞則未表現(xiàn)出啟動子活性。另外，與未處理的F383-I1比較，經(jīng)過Sss I甲基化酶和5'-AZA去甲基化藥物處理的F383-I1的Firefly Lux／Renilla Luc比值明顯降低和升高(p<0.05)。 　　3.人胃癌細胞株PDX1啟動子CpG島呈高度甲基化

14、狀態(tài)的MSP分析PDX1四個CpG島在6株細胞(AGS、BCG823、SGC7901、MKN45、TMK1、SNU1)中均有完全甲基化或部分甲基化。 4.人胃癌細胞株CpG-I1甲基化狀態(tài)的BSP分析6株人胃癌細胞(AGS、BCG823、SGC7901、MKN45、TMK1、SNU1)均表現(xiàn)出高度的的CpG-I1甲基化率(77.5％±4.4％、97.1％±1.9％、82.4％±5.9％、88.2％±5.3％、81.8％±2.8％

15、、97.1％±1.3％)；而兩例對照癌旁正常組織的CpG-I1甲基化率僅為1.9％±1.2％、1.0％±1.0％。 5.人胃癌組織CpG-I1甲基化MSP分析30例胃癌組織全部有CpG-I1甲基化(3例(10％)完全甲基化，27例(90％)部分甲基化)，而癌旁正常組織則有16例(53.33％)無甲基化，其余14例(46.67％)表現(xiàn)部分甲基化。 結論： 1.啟動子CpG島甲基化與PDXl基因在胃癌的表達下調相關；