糖尿病Pdx1抗原免疫治療及骨髓干細胞促INS-1細胞修復作用的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分Pdx1抗原免疫治療延緩了NOD小鼠糖尿病的發(fā)病
　　 1型糖尿病特點為自身反應性T細胞識別一系列胰島特異性抗原,導致胰島β細胞的選擇性破壞。多種自身抗原可用于指導免疫治療,包括胰島素抗原、谷氨酸脫羧酶抗原、胰島細胞抗原等。自身反應性T細胞針對這些抗原的反應存一定的等級,自身反應性T細胞對胰島素抗原的識別反應被認為是位于對其他抗原反應的上游。胰島素特異性的免疫治療在1型糖尿病嚙齒類動物模型身上顯示出一些保護作用,然而,胰

2、島素抗原特異性的免疫治療在糖尿病臨床治療方面療效不佳。這暗示著抗原特異性的免疫治療原理十分復雜,或許,糖尿病患者體內(nèi)存在其他一些未知的自身抗原,利用這些未知的自身抗原免疫可能會產(chǎn)生更好的治療效果。
　　 胰腺十二指腸同源盒1是胰腺發(fā)育中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,在β細胞的分化和功能維持方面也起著十分重要的作用。在成熟的β細胞,Pdx1參與胰島素基因表達的調(diào)控。在我們以前發(fā)表的文章中,我們報道了基因重組Pdx1蛋白可改善脲鏈佐菌素所致的糖尿

3、病小鼠的血糖水平,通過促進胰腺的再生和促進肝細胞分化為胰島素分泌細胞而起作用。進而,我們發(fā)現(xiàn)Pdx1是非肥胖糖尿病小鼠小鼠體內(nèi)新的胰島β細胞特異性的自身抗原,在NOD小鼠糖尿病的初期和糖尿病期,以及一部分糖尿病患者體內(nèi)都可檢測到針對Pdxl的自身抗體?！甆OD小鼠是模擬l型糖尿病較好的動物模型,雌性的NOD小鼠一般在12-14周齡左右自發(fā)進展為糖尿病,其特點為T細胞介導的胰島免疫浸潤和胰島β細胞免疫破壞。在這個試驗中,我們嘗試不同的抗原

4、輸注方法,觀察Pdx1蛋白免疫治療是否可延緩NOD小鼠糖尿病的發(fā)病,并進行了脾細胞過繼移植實驗、體內(nèi)T細胞增殖實驗、胰腺免疫組化、細胞流式分析、實時定量PCR及體外T細胞增殖實驗等相關(guān)研究,以分析其免疫治療機制。
　　 目的：
　　 研究Pdx1免疫治療是否會延緩雌性‘NOD小鼠糖尿病的發(fā)病及可能的免疫治療機制。
　　 方法
　　 在這個試驗中,七或十周齡的NOD小鼠接受Pdx1的免疫治療。因為治療效果可

5、以受很多因素的影響,我們試驗中嘗試了不同的抗原輸注方法,以及不同的抗原輸注劑量和時間。不同的抗原輸注方法包括腹腔注射、皮下注射或口服:不同的輸注劑量和時間是指用于實驗的NOD小鼠分別選自7周或10周,接受Pdx1的免疫治療維持的周數(shù)也有所不同。每周檢測NOD小鼠血糖狀況,血糖水平大于11.1 mmol/l并持續(xù)兩天被認為是糖尿病發(fā)病。
　　 為明確其可能的機制,進行了以下分析:
　　 (1)過繼移植實驗:將接受Pdx1免

6、疫的NOD小鼠的脾細胞分離出,移植入非肥胖糖尿病、重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠體內(nèi),觀察NOD-SCID小鼠糖尿病的發(fā)病情況；
　　 (2)體內(nèi)T細胞增殖實驗:將CD4+T細胞從NOD.BDC2.5小鼠的脾臟中分離出,體外經(jīng)熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯標記后,經(jīng)尾靜脈注射入Pdx1蛋白處理過的NOD小鼠體內(nèi)；5天以后,將NOD小鼠的胰腺淋巴結(jié)細胞和腹股溝淋巴結(jié)細胞分離出,細胞流式評估CFSE標記的CD4+T細胞在NOD小鼠體內(nèi)

7、增殖的情況；
　　 (3)胰腺免疫組化研究:M-Pdx1蛋白處理的NOD小鼠接受胰腺免疫組化研究。胰島組織切片行HE染色和胰島素染色,并對胰島炎進行評分；
　　 (4)細胞流式:細胞流式分析M-Pdx1蛋白免疫NOD小鼠是否可改變脾臟、胰腺淋巴結(jié)中CD4+/CD8+T細胞的比例,分析CD4+FoxP3+Treg、IL-10分泌細胞和Th-17細胞等的變化情況,細胞流式分析IL-4、IL-10、IFN-γ等細胞因子表達情況

8、；
　　 (5)實時熒光定量PCR分析M-Pdx1蛋白免疫NOD小鼠對各種細胞因子基因表達的影響,包括IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-α、TGF-β及FoxP3等；
　　 (6)T細胞體外增殖實驗:觀察Pdx1蛋白免疫的NOD小鼠,脾臟淋巴細胞對不同抗原刺激的體外增殖情況；
　　 結(jié)果：
　　 與對照組相比,將Pdx1蛋白腹腔或皮下輸注免疫NOD小鼠可較好地延緩NOD小鼠糖

9、尿病的發(fā)病,但口服Pdx1蛋白沒有顯示出明顯的免疫預防效果。
　　 對照組PBS處理的NOD小鼠的脾細胞過繼轉(zhuǎn)移給NOD-SCID小鼠時,轉(zhuǎn)移后大多3周內(nèi)發(fā)生糖尿病。將Pdx1(或M-Pdx1蛋白)處理的NOD小鼠的脾細胞過繼轉(zhuǎn)移給NOD-SCID小鼠時,NOD-SCID小鼠發(fā)生糖尿病的時間明顯推遲。這提示Pdx1(或M-Pdx1蛋白)免疫NOD小鼠可能激活免疫調(diào)節(jié)細胞,且這種保護作用是可轉(zhuǎn)移的。
　　 CFSE標記的C

10、D4+T細胞過繼轉(zhuǎn)移實驗:在腹股溝淋巴結(jié),M-Pdx1蛋白(或?qū)φ盏鞍?處理的NOD小鼠,CFSE標記的NOD.BDC2.5 CD4+T細胞都無明顯增殖,無明顯的統(tǒng)計學差異(p>0.05)；而在胰腺淋巴結(jié),對照組NOD小鼠胰腺淋巴結(jié)內(nèi)CFSE標記的NOD.BDC2.5 CD4+T細胞增殖明顯,與M-Pdx1蛋白處理的NOD小鼠形成明顯的反差,M-Pdx1蛋白處理的NOD小鼠NOD.BDC2.5 CD4+T細胞增殖受到抑制(p<0.05)

11、。此結(jié)果表明M-Pdx1蛋白處理可能誘導NOD小鼠體內(nèi)Treg的產(chǎn)生,從而對移植入體內(nèi)的CFSE標記的NOD.BDC2.5 CD4+T細胞的增殖產(chǎn)生抑制調(diào)節(jié)作用。
　　 胰腺免疫組化結(jié)果顯示:對照組NOD小鼠胰島淋巴細胞浸潤較嚴重,胰島素染色陽性的β細胞數(shù)量降低,胰高血糖素細胞代償性增多。與此對比,經(jīng)M-Pdx1處理的NOD小鼠淋巴細胞浸潤減少,胰島素染色陽性的β細胞占胰島細胞的絕大部分,胰島炎評分優(yōu)于對照組。
　　 細

12、胞流式結(jié)果表明:M-Pdx1免疫NOD小鼠可上調(diào)脾細胞內(nèi)CD4+Foxp3+Treg的比例和IL-10分泌細胞的比例。M-Pdx1免疫NOD小鼠可下調(diào)Th-17細胞的比例；而CD4+/CD8+的比值、IFN-γ分泌細胞的比例等無明顯變化。
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示:利用M-Pdx1蛋白免疫處理NOD小鼠可上調(diào)Th2相關(guān)基因的表達,如IL-4,IL-10,Foxp3,TGF-α及TGF-β；下調(diào)Th1相關(guān)基因的表達

13、,如IL-2,IFN-γ等。同時,利用M-Pdx1蛋白免疫NOD小鼠可提高FoxP3基因的表達。
　　 體外T細胞增殖實驗:對照組NOD小鼠分離出的T細胞對Pdx1蛋白抗原刺激表現(xiàn)出明顯的增殖,與Pdx1蛋白免疫處理的NOD小鼠相比,p<0.05；這提示利用Pdx1蛋白免疫NOD小鼠可導致體內(nèi)Pdx1抗原特異性的自身反應性T細胞功能降低。通過Pdx1蛋白免疫NOD小鼠,T細胞對胰島素的增殖反應也降低。利用Pdx1蛋白免疫的NOD

14、小鼠T細胞分泌IFN-γ的水平降低。
　　 結(jié)論：利用Pdx1蛋白(或M-Pdx1蛋白)免疫NOD小鼠可較好地預防NOD小鼠糖尿病的發(fā)病,其機制可能為誘導自身反應性T細胞無反應性或克隆清除,誘導CD4+Foxp3+Treg細胞的產(chǎn)生,上調(diào)IL-10分泌細胞比例,下調(diào)Th-17細胞的數(shù)量,以及影響Th1細胞與Th2細胞的比例。利用Pdx1抗原免疫治療1型糖尿病是一個很有希望的治療方法。
　　 第二部分
　　 利用共

15、培養(yǎng)微流控細胞芯片觀察骨髓間充質(zhì)干細胞是否可改善
　　 IL-1β/IFN-γ所導致的INS-1細胞凋亡及功能不全
　　 目的：
　　 利用微流控細胞芯片技術(shù)制作共培養(yǎng)細胞芯片,將骨髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和INS-1細胞進行共培養(yǎng),我們觀察BM-MSCs所分泌的一些細胞因子是否可改善IL-1β/IFN-T所導致的INS-

16、1細胞凋亡及功能不全。
　　 方法
　　 設(shè)計制備共培養(yǎng)微流控細胞芯片。BM-MSCs從糖尿病患者中獲取,細胞流式分析細胞表面分子的表達。將BM-MSCs和INS-1細胞分別接種于微流控芯片不同的培養(yǎng)小室,保持培養(yǎng)液從BM-MSCs向INS-1細胞的單向流動。INS-1細胞培養(yǎng)基中添加細胞因子IL-1β及IFN-γ,同時INS.1細胞也接受BM.MSCs培養(yǎng)液的影響。Annexin V/PI雙染分析BM-MSCs對IL-

17、1β/IFN-γ所致的細胞凋亡的抑制作用；應用RIA分析BM-MSCs是否可改善IL-1β/IFN-γ所致的INS-1細胞胰島素分泌功能不全。免疫熒光和實時熒光定量PCR分析IL-1β/IFN-γ及BM-MSCs對INS-1細胞胰島素含量及胰島素基因表達的影響。
　　 結(jié)果：
　　 微流控細胞芯片可以確保培養(yǎng)液從BM-MSCs向INS-1細胞的單向持續(xù)的流動,是體外觀察兩種細胞間單向作用的好工具。在此試驗中,在不同的時間

18、可觀察到IL-1β/IFN-γ可導致INS-1細胞凋亡和胰島素分泌功能受損,BM-MSCs所分泌的一些細胞因子可改善IL-1β/IFN-γ所導致的INS-1細胞凋亡和胰島素分泌功能受損,增加細胞內(nèi)胰島素的含量,促進胰島素基因的表達。
　　 結(jié)論：
　　 共培養(yǎng)微流控細胞芯片是體外觀察干細胞與其他細胞作用的好工具。BM-MSCs可能通過分泌一些抗炎性、抗凋亡和營養(yǎng)因子促進INS-1細胞的存活,促進INS-1細胞胰島素分泌及