血漿FHIT基因啟動(dòng)子甲基化與胃癌發(fā)病的相關(guān)性研究.pdf

1、胃癌死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中居首位，胃鏡檢查確診早期胃癌因其有創(chuàng)性和不易操作性難以普遍開展。正常人循環(huán)血中存在少量游離DNA，即循環(huán)DNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤患者循環(huán)DNA與正常人相比有很大差異，是一種有潛力的腫瘤標(biāo)志物。啟動(dòng)子甲基化近年來被認(rèn)為是腫瘤中抑癌基因改變的主要途徑。脆性組氨酸三連體(fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)基因是1996年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)候選抑癌基因，大量研究表明，F(xiàn)HIT基因啟動(dòng)子甲基化與胃

2、癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究對(duì)胃癌患者進(jìn)行血漿中FHIT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的檢測(cè)，結(jié)合臨床病理資料，探討FHIT基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和可能的作用機(jī)制，利用FHIT基因啟動(dòng)子甲基化為血清學(xué)分子標(biāo)志物，對(duì)胃癌進(jìn)行早期診斷與療效評(píng)估。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、標(biāo)本來源( 1) 實(shí)驗(yàn)組：胃癌患者血漿42例(經(jīng)胃鏡和病理確診)，選自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院腫瘤外科2007年1月至2007年6月住院患

3、者，未進(jìn)行手術(shù)和放化療等治療，年齡在30-70歲之間； (2) 對(duì)照組：健康志愿者血漿15例(6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過健康體檢，未確診任何臨床疾病)，男女各半，年齡在30-70歲之間； 2、實(shí)驗(yàn)試劑 Wizard DNA純化試劑盒(Promega)Sss I methylase (NEB) Sodium Bisulfite(Sigma S-9000)Hydroquinone(Sigma H-9003)Glyoogen(Si

4、gma G-8751)Wizard DNA Clean-Up(Promega)Ex Taq enzyme dNTP(TaKaRa)等。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)血漿的分離——血漿DNA的提取——DNA的亞硫酸氫鹽修飾——甲基化及非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增——2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)——凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相； 2、對(duì)照設(shè)置 陽(yáng)性對(duì)照為健康志愿者外周血基因組DNA經(jīng)甲基化酶修飾后的產(chǎn)物

5、，陰性對(duì)照以DDW為模板的對(duì)照。 3、判斷標(biāo)準(zhǔn) 以甲基化引物擴(kuò)增出陽(yáng)性片段(無論非甲基化引物是否擴(kuò)出陽(yáng)性片段)作為陽(yáng)性結(jié)果；以非甲基化引物擴(kuò)出陽(yáng)性片段(且甲基化引物未擴(kuò)出陽(yáng)性片段)作為陰性結(jié)果。 4、統(tǒng)計(jì)處理 用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用x2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher’s檢驗(yàn)，P<0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、胃癌患者血漿中FHIT、基因甲基化率為30.95％，

6、明顯高于健康組，且兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 2、隨著組織分化程度的增加，甲基化率有下降的趨勢(shì)，在高、中分化/低、未分化組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 3、FHIT基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率與患者的年齡、性別、腫瘤大小、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床大體分期及病理類型等臨床和病理資料之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。 結(jié)論： 1、FHIT基因啟動(dòng)子甲基化在胃癌組中的發(fā)生率較健康對(duì)照組中明顯升高，提示胃癌患者血