鈣非依賴型磷脂酶A-,2-對間歇性高糖誘導的大鼠胰島微血管內皮細胞凋亡的影響.pdf

1、隨著近年來對胰島糖毒性研究的不斷進展，氧化應激受到了更多學者的關注。高糖導致活性氧簇（ROS）生成增多，氧化應激成為細胞損傷的共同土壤。如何避免或修復因ROS增多導致的胰島血管內皮損傷，對于維持胰島微循環(huán)的正常運行從而最終延緩胰島細胞本身功能的衰竭及抗損傷能力具有重要的意義。 磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一個包含多種不同亞型的蛋白超家族，具有水解甘油磷酸酯sn-2位脂肪酸能力的特性。PLA2超家族根

2、據其生化特性的不同，主要分為以下四種類型，即：1．鈣依賴型分泌型磷脂酶A2（sPLA2）；2．鈣依賴型胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）；3．鈣非依賴型磷脂酶A2（iPLA2）；4．血小板活化因子乙?；饷福≒AF-AH）。iPLA2是Ⅵ型PLA2，作為一組重要的PLA2亞型，它具有分解膜磷脂sn-2脂肪酰鍵、釋放出游離脂肪酸和溶血磷脂，后者作為受體結合花生四烯酸，進而轉化為膜磷脂，與磷脂重塑密切相關。iPLA2抑制劑BEL或iPLA2的

3、反義寡核苷酸均可抑制溶血磷脂酰膽堿的形成，抑制花生四烯酸結合到膜磷脂上，因此iPLA2可能參與了細胞生物膜磷脂的重塑，尤其是對線粒體膜具有重要的膜修復功能。由于線粒體內膜富含心磷脂，且十分靠近活性氧的生成部位，極易受到活性氧的攻擊。有研究顯示iPLA2主要定位于線粒體，通過轉染使其高表達于胰島細胞株INS-1上，能夠緩解線粒體膜損傷。細胞本身具有氧化-抗氧化的平衡能力，其具有利用自身天然的脂肪酸修復或清除膜上過氧化的脂肪酸殘體，這一過程

4、需要PLA2超家族成員的參與。iPLA2可以通過乙酰化一去乙?；h(huán)參與膜磷脂的重塑和修復的初始過程。 iPLA2具有多種生物學功能，尤其是在膜磷脂重塑方面可能成為防治細胞損傷的新靶點。分子生物學檢測方法日益更新，在間歇性高糖對微血管內皮細胞的研究中，探尋iPLA2是否參與這一病理生理過程，可以進一步了解iPLA2的作用功能及機制，并為疾病的發(fā)生及治療研究展示廣闊的前景。 目的: 本課題擬通過純化大鼠胰島獲得I

5、MECs，通過間歇性高糖誘導，觀測其對IMECs的毒性作用。初步探討iPLA2在間歇性高糖誘導下的病理改變及對大鼠IMECs凋亡的作用機制。 內容: 課題分以下三個部分： 一、大鼠IMECs的純化、鑒定及培養(yǎng) 目的: 建立高效的大鼠IMECs分離純化方法。 方法: 1．大鼠胰島的分離純化及鑒定 取成年Wistar大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0．8g/L膠原酶P灌注胰腺

6、進行消化分離。消化后通過Ficoll不連續(xù)密度梯度液純化胰島。DTZ染色鑒定胰島及臺盼藍檢測純度。 2．大鼠IMECs的純化 分離純化的大鼠胰島培養(yǎng)于內皮細胞選擇性培養(yǎng)基，待IMECs從胰島周邊爬出后，使用UEA-1包被的免疫磁珠對IMECs進行純化。 3．大鼠IMECs的鑒定 免疫熒光法檢測經典的內皮細胞標志物第Ⅷ因子相關抗原（vWF）、CD34的表達和吞噬Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-

7、LDL）的能力。 4．大鼠IMECs的培養(yǎng) 純化后的細胞接種在2%明膠包被的T25培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。每2～3天換1次內皮細胞完全培養(yǎng)液，待細胞生長至完全匯合時，進行消化傳代。細胞傳至第5～6代后增殖較快，可用于實驗。 結果: 大鼠胰腺純化前平均可獲取434±39胰島當量（islet equivalent，IEQ）的胰島，純化后可獲取265±45IEQ，純度為（86±5．42）%。純化

8、所得大鼠胰島經培養(yǎng)3天后貼壁，5～6天可見IMECs從胰島周邊爬出，7～9天細胞逐漸融合成片。經UEA-1包被的免疫磁珠與大鼠IMECs選擇性結合，用磁力分離器收集后得到高純度的內皮細胞。懸浮于培養(yǎng)液中，1h后大部分細胞貼壁，6h后大部分伸展，5天后細胞能增殖，鋪滿再傳代，具有單層生長和接觸抑制的特性。擴增培養(yǎng)至第5代時細胞上基本沒有磁珠存在。使用免疫熒光檢測試劑盒檢測磁珠純化后的IMECs，結果顯示分離純化后的IMECs表達內皮細胞的

9、標志分子vWF、CD34，并具有攝取Dil-Ac-LDL的能力。 結論: 成功建立了大鼠IMECs的分離純化方法。 二、間歇性高糖對大鼠IMECs氧化應激的影響 目的: 探討間歇性高糖對大鼠IMECs氧化應激的影響及相關機制。 方法: 1．實驗分組 正常葡萄糖組：加入5mmol/L葡萄糖濃度的DMEM細胞培養(yǎng)液；恒定性高糖組：加入28mmol/L糖濃度的DMEM細胞培養(yǎng)液；

10、間歇性高糖組：每24h輪換加入5mmol/L或28mmol/L糖濃度的DMEM細胞培養(yǎng)液。每組各3個培養(yǎng)孔，每個實驗重復3次。 2．DNA片段化檢測IMECs凋亡 采用DNA ladder試劑盒檢測各組細胞，DNA產物于1．5%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察并經凝膠成像系統(tǒng)照相。 3．AnnexinⅤ/PI流式檢測IMECs凋亡率 按AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒說明書要求處理細胞后，經流式細胞儀利用

11、FL1和FL3雙通道波長檢測。 4．IMECs凋亡蛋白酶caspase-3活性的檢測 按caspase-3試劑盒說明書處理細胞后，采用連續(xù)光譜熒光儀檢測各反應孔的熒光強度。 5．IMECs中ROS濃度的檢測 吸盡孔中培養(yǎng)液后，按照試劑盒說明書依次添加試劑，經流式細胞儀進行檢測。 6．IMECs中黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）含量的檢測 按XOD檢測試劑盒說明書先配

12、制試劑后處理各組細胞，用酶標儀在550nm波長讀取每孔的OD值。 7．IMECs線粒體膜電位的檢測 配置DIOC6（3）工作液后與IMECs共孵育，經流式細胞儀進行熒光檢測。統(tǒng)計學處理 數(shù)據采用SPSS11．0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據以均數(shù)±標準差（x+s）表示，第二章統(tǒng)計方法全部采用單向方差分析，兩兩比較采用LSD法，P<0．050具有統(tǒng)計學意義。 結論: 本研究觀測到恒定性高糖及間歇性高糖均促進IM

13、ECs發(fā)生凋亡，間歇性高糖對IMECs凋亡的誘導作用更強。與恒定性高糖比較，間歇性高糖培養(yǎng)條件下，caspase-3酶活性增高更加顯著，IMECs黃嘌呤氧化酶含量增高更為明顯，ROS產生更多，線粒體膜電位明顯下降。間歇性高糖比持續(xù)性高糖對IMECs的氧化應激損傷更大，可能是其導致凋亡增多的機制之一。 三、鈣非依賴型磷脂酶A2對間歇性高糖誘導的大鼠胰島微血管內皮細胞凋亡的影響 目的: 通過小分子RNA干擾技術抑制I

14、MECs中iPLA2的表達，初步探討其對間歇性高糖誘導的IMECs凋亡的影響。 方法: 1．RT-PCR檢測IMECs的iPLA2 mRNA表達 分別用正常糖、恒定性高糖和間歇性高糖誘導IMECs7天后，依次進行細胞總RNA的提取、RNA逆轉錄cDNA和PCR實驗。PCR產物在1．5%的瓊脂糖凝膠電泳顯示。 2．iPLA2的siRNA的合成及轉染 iPLA2雙股RNA干擾序列由上海吉瑪制藥技術有

15、限公司合成，陰性對照RNA干擾序列為不與大鼠mRNA同源的基因。應用RT-PCR鑒定轉染結果。 3．凋亡檢測 用DNA ladder和流式細胞儀檢測iPLA2表達抑制后IMECs在間歇性高糖條件下凋亡的情況。（方法同第二章） 4．線粒體膜電位的檢測：抑制iPLA2表達后，采用流式細胞術檢測間歇性高糖條件下IMECs的線粒體膜電位的變化。（方法同第二章） 5．檢測細胞ROS生成情況。（方法同第二章）

16、 統(tǒng)計學處理 數(shù)據采用SPSS11．0進行統(tǒng)計分析．數(shù)據以均數(shù)±標準差（x±s）表示，第三章統(tǒng)計方法采用析因設計的方差分析，其中兩兩比較采用t檢驗，三組比較采用單向方差分析。P<0．050具有統(tǒng)計學意義。 結論: 間歇性高糖及恒定性高糖均能誘導IMECs凋亡，并不同程度的影響到iPLA2mRNA的表達，間歇性高糖的抑制作用最強。在間歇性高糖培養(yǎng)條件下，通過轉染siRNA抑制iPLA2的表達進一步促進了IMECs內