豇豆胰蛋白酶抑制劑基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其蛋白純化.pdf

1、本研究從原核表達(dá)載體pGEX4T-CpTI上亞克隆得到豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因，通過(guò)SnaBI和NotⅠ雙酶切作用，將CpTI基因按照載體閱讀框轉(zhuǎn)譯方向插入到表達(dá)質(zhì)粒PpIC9K的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PpIC9K/CpTI。利用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表型為His-的宿主菌KM71，利用MD培養(yǎng)基篩選到500多個(gè)轉(zhuǎn)化子，再經(jīng)G418抗性的二次篩選，獲得5株含高拷貝cPTI基因的重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)對(duì)五株高拷貝重

2、組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵表達(dá)，成功獲得一株高效分泌表達(dá)的重組菌株，并在發(fā)酵上清中可直接檢測(cè)到CpTI，其大小為15kD，比理論值多5kD，但是和豇豆中提取的CpTI蛋白大小一致，推測(cè)是由于兩種不同來(lái)源的蛋白有相似的糖基化修飾造成的。 對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到重組畢赤酵母表達(dá)CpTI的最佳發(fā)酵條件為：以BMMY和BMGY為發(fā)酵培養(yǎng)基、裝液量10％、28℃、225rpm，培養(yǎng)基起始pH值為6，甲醇濃度2％，誘導(dǎo)5天。該條件下發(fā)酵所得的