水蛭源性類(lèi)胰蛋白酶抑制劑基因的克隆與表達(dá).pdf

1、目的：
　　構(gòu)建水蛭源性類(lèi)胰蛋白酶抑制劑(LDTI)原核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌[BL21(DE3)]中優(yōu)化表達(dá)條件,以期獲得重組類(lèi)胰蛋白酶抑制劑的高效表達(dá),并為進(jìn)一步研究水蛭源性類(lèi)胰蛋白酶抑制劑的生化特性,生物學(xué)功能及其對(duì)于肥大細(xì)胞影響和對(duì)過(guò)敏性疾病的潛在治療作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.基因克隆
　?、?LDTI基因擴(kuò)增:以含目的基因片段的質(zhì)粒為模板,運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出LDTI基因,通過(guò)瓊脂糖凝膠

2、電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。
　　② T克隆載體的構(gòu)建:將上步所得DNA片段與pMD18-T載體連接,構(gòu)建含目的片段的T載體克隆,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌[JM109],擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,通過(guò)菌落PCR,以及限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切和基因測(cè)序進(jìn)行質(zhì)粒鑒定。
　　③ pET28a-LDTI載體的構(gòu)建:對(duì)上述T載體進(jìn)行雙酶切,取目的片段與經(jīng)過(guò)雙酶切的pET28a片段連接,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-LDTI重組質(zhì)粒亞克隆,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌[JM10

3、9],擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,進(jìn)行菌落PCR、限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切和基因測(cè)序鑒定。
　　2.蛋白表達(dá)
　?、?pET28a-LDTI表達(dá)載體轉(zhuǎn)化[BL21(DE3)]。
　?、?IPTG誘導(dǎo)pET28a-LDTI基因表達(dá)目的蛋白。經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳及Western blot方法鑒定蛋白。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間和IPTG的誘導(dǎo)濃度,誘導(dǎo)重組蛋白快速大量表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.瓊脂糖凝膠電泳圖像上

4、在約140bp處可見(jiàn)一條亮帶,表明成功擴(kuò)增了目的基因片段。
　　2.菌落PCR,雙酶切以及基因測(cè)序結(jié)果顯示利用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建了T克隆載體。
　　3.菌落PCR,雙酶切以及基因測(cè)序結(jié)果顯示利用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建了pET28a-LDTI表達(dá)載體。
　　4.pET28a-LDTI重組子可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并且可以高效表達(dá)LDTI,在Tricine-SDS-PAGE電泳圖像上約6.8KD處表現(xiàn)為一條粗蛋白帶。符合We