粟酒裂殖酵母核糖體蛋白R(shí)PL32-2的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子篩選研究.pdf

1、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的核糖體蛋白R(shí)PL32的兩個(gè)同源蛋白R(shí)PL32-1和RPL32-2在功能上既有類(lèi)似可以相互替代的方面，同時(shí)也存在功能的分化。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，RPL32-1，-2這兩個(gè)同源蛋白在細(xì)胞不同生長(zhǎng)階段具有不同表達(dá)以及不同的生理意義，當(dāng)RPL32的總蛋白量保持不變時(shí)，同源基因相互競(jìng)爭(zhēng)抑制另一個(gè)同源基因的表達(dá);當(dāng)細(xì)胞處于沉默狀態(tài)時(shí)，RPL32-1高表達(dá)抑制細(xì)胞分裂;而細(xì)胞處

2、于對(duì)數(shù)期時(shí)，RPL32-2呈現(xiàn)高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分裂。然而RPL32-1，RPL32-2為什么會(huì)在不同時(shí)期有不同的表達(dá)量？產(chǎn)生這樣功能分化的原因是什么呢？由此本文開(kāi)展了RPL32-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究。
　　我們首先利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)rpl32-2的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選。本研究構(gòu)建了高質(zhì)量的酵母cDNA文庫(kù)，利用構(gòu)建的帶有rpl32-2啟動(dòng)子的誘餌菌株，從cDNA文庫(kù)中篩選可能的rpl32-2轉(zhuǎn)錄因子，共獲得109個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)

3、獲得的陽(yáng)性克隆cDNA序列分析，經(jīng)過(guò)NCBI比對(duì)得出了43種可能的結(jié)合蛋白，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，出現(xiàn)頻率較高的可能的結(jié)合蛋白有6種，其中有五種核糖體蛋白R(shí)PS6-1，RPL5-2，RPS10-1，RPL27-1，RPL5-1以及一種翻譯延伸因子EF1B，其出現(xiàn)頻率分別為11.93％，11.93％，8.26％，6.42％，5.50％，11.01％。推測(cè)這些蛋白有可能是rpl32-2的轉(zhuǎn)錄因子。
　　為驗(yàn)證上述假說(shuō)，我們通過(guò)構(gòu)建pGADT

4、7+ rps6-1，pGADT7+rps10-1，pGADT7+rpl5-1，pGADT7+rpl5-2，pGADT7+rpl27-1，pGADT7+ef1b重組質(zhì)粒，通過(guò)再轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RPL5-1，RPL5-2，RPS6-1均可能與rpl32-2的啟動(dòng)子產(chǎn)生相互作用。我們得出結(jié)論RPL5-1，RPL5-2，RPS6-1都有可能是rpl32-2的轉(zhuǎn)錄因子。但由于單雜交實(shí)驗(yàn)本身存在一定的局限性，存在假陽(yáng)性的可能，所以我們需

5、要通過(guò)其他的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　本文針對(duì)rpl32-2啟動(dòng)子與核糖體蛋白R(shí)PL5-1之間有無(wú)相互作用，通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)從體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。我們首先構(gòu)建帶有RPL5-1-HA標(biāo)簽的酵母菌株，利用HA抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀，以ChIP的純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但并沒(méi)有從中擴(kuò)增出rpl32-2啟動(dòng)子DNA片段。所以我們得出結(jié)論，rpl32-2的啟動(dòng)子與RPL5-1蛋白之間沒(méi)有相互作用，之前的單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果為假陽(yáng)性。<