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1、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的核糖體蛋白R(shí)PL32的兩個(gè)同源蛋白R(shí)PL32-1和RPL32-2在功能上既有類(lèi)似可以相互替代的方面,同時(shí)也存在功能的分化。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn),RPL32-1,-2這兩個(gè)同源蛋白在細(xì)胞不同生長(zhǎng)階段具有不同表達(dá)以及不同的生理意義,當(dāng)RPL32的總蛋白量保持不變時(shí),同源基因相互競(jìng)爭(zhēng)抑制另一個(gè)同源基因的表達(dá);當(dāng)細(xì)胞處于沉默狀態(tài)時(shí),RPL32-1高表達(dá)抑制細(xì)胞分裂;而細(xì)胞處
2、于對(duì)數(shù)期時(shí),RPL32-2呈現(xiàn)高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分裂。然而RPL32-1,RPL32-2為什么會(huì)在不同時(shí)期有不同的表達(dá)量?產(chǎn)生這樣功能分化的原因是什么呢?由此本文開(kāi)展了RPL32-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究。
我們首先利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)rpl32-2的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選。本研究構(gòu)建了高質(zhì)量的酵母cDNA文庫(kù),利用構(gòu)建的帶有rpl32-2啟動(dòng)子的誘餌菌株,從cDNA文庫(kù)中篩選可能的rpl32-2轉(zhuǎn)錄因子,共獲得109個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)
3、獲得的陽(yáng)性克隆cDNA序列分析,經(jīng)過(guò)NCBI比對(duì)得出了43種可能的結(jié)合蛋白,通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,出現(xiàn)頻率較高的可能的結(jié)合蛋白有6種,其中有五種核糖體蛋白R(shí)PS6-1,RPL5-2,RPS10-1,RPL27-1,RPL5-1以及一種翻譯延伸因子EF1B,其出現(xiàn)頻率分別為11.93%,11.93%,8.26%,6.42%,5.50%,11.01%。推測(cè)這些蛋白有可能是rpl32-2的轉(zhuǎn)錄因子。
為驗(yàn)證上述假說(shuō),我們通過(guò)構(gòu)建pGADT
4、7+ rps6-1,pGADT7+rps10-1,pGADT7+rpl5-1,pGADT7+rpl5-2,pGADT7+rpl27-1,pGADT7+ef1b重組質(zhì)粒,通過(guò)再轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RPL5-1,RPL5-2,RPS6-1均可能與rpl32-2的啟動(dòng)子產(chǎn)生相互作用。我們得出結(jié)論RPL5-1,RPL5-2,RPS6-1都有可能是rpl32-2的轉(zhuǎn)錄因子。但由于單雜交實(shí)驗(yàn)本身存在一定的局限性,存在假陽(yáng)性的可能,所以我們需
5、要通過(guò)其他的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
本文針對(duì)rpl32-2啟動(dòng)子與核糖體蛋白R(shí)PL5-1之間有無(wú)相互作用,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)從體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。我們首先構(gòu)建帶有RPL5-1-HA標(biāo)簽的酵母菌株,利用HA抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀,以ChIP的純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,但并沒(méi)有從中擴(kuò)增出rpl32-2啟動(dòng)子DNA片段。所以我們得出結(jié)論,rpl32-2的啟動(dòng)子與RPL5-1蛋白之間沒(méi)有相互作用,之前的單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果為假陽(yáng)性。<
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