粟酒裂殖酵母中Mpa1定位及功能的研究.pdf

1、線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝，糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，為細(xì)胞的生命活動提供能量，是細(xì)胞氧化磷酸化和形成ATP的主要場所，有細(xì)胞“動力工廠”之稱。另外，線粒體有自身的DNA和遺傳體系，但基因組的基因數(shù)量有限，因此，線粒體只是一種半自主性的細(xì)胞器。線粒體的表達(dá)障礙直接導(dǎo)致各種各樣的疾病，如何治療線粒體疾病成為目前的研究重點。許多研究表明，線粒體功能異常與帕金森氏癥、阿爾茲海默病、糖尿病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，既是疾病

2、病因之一，又是疾病發(fā)病的早期征兆。因此研究線粒體基因表達(dá)機(jī)制，可以為治療線粒體基礎(chǔ)疾病提供幫助。Mpa1是我們實驗室通過串聯(lián)親和純化(Tandem affinity purification)、免疫共沉淀和質(zhì)譜（mass spectrometry）鑒定技術(shù)，發(fā)現(xiàn)的與Ppr10有體內(nèi)相互作用的蛋白。mpa1是未被研究過的一個新穎的基因，因而本研究選擇mpa1基因作為研究對象。
　　本研究借助在線工具M(jìn)itoProtⅡ(https:/

3、/ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)分析結(jié)果得知，Ppr10含有線粒體的定位信號肽，但是無法預(yù)測到Mpa1的線粒體定位信號肽。由于Mpa1與Ppr10蛋白存在體內(nèi)相互作用，猜測Mpa1與Ppr10共定位。為了進(jìn)一步明確Mpa1的定位，對Mpa1做了亞細(xì)胞定位，最終確定Mpa1定位于線粒體基質(zhì)。為了研究Mpa1的相關(guān)功能，首先以單倍體酵母菌株yHL6381為出發(fā)菌株構(gòu)建了mpa1基因缺失突變株。接下來，針對突變株進(jìn)

4、行了一系列的表型研究:包括生長曲線測定，細(xì)胞形態(tài)觀察，不同生長階段的存活能力、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和非發(fā)酵性培養(yǎng)基上的生長狀況及對線粒體呼吸鏈抑制劑抗霉素A的敏感性研究。表型研究結(jié)果表明，mpa1基因缺失突變株在與呼吸功能相關(guān)的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出生長缺陷，并且在生長階段后期生存能力嚴(yán)重受損?？偟膩碚f△mpa1是線粒體呼吸缺陷菌株。同時，Western Blot技術(shù)進(jìn)一步分析得出，mpa1的缺失導(dǎo)致線粒體相關(guān)蛋白的合成量降低。本實驗成功構(gòu)建了△mpa

5、1/pJK148-1500-mpa1-3HA菌株，且可以正常表達(dá)Mpa1蛋白。點圈實驗證明菌株可以彌補(bǔ)mpa1基因缺失突變株在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長缺陷，同時Western Blot證明回補(bǔ)菌株可以恢復(fù)線粒體蛋白的合成。由此可知，mpa1的自身調(diào)控序列在5'-UTR上游1500 bp范圍內(nèi)，并驗證了mpa1是非必需基因。在此基礎(chǔ)上，對缺失特定區(qū)域的Mpa1結(jié)構(gòu)的研究。無論缺失哪部分區(qū)域，都可以正常表達(dá)Mpa1，但都不能彌補(bǔ)可以彌補(bǔ)mpa1