粟酒裂殖酵母RNA組學(xué)：box C-D snoRNA篩選及基因組織和表達(dá)研究.pdf

1、本文通過構(gòu)建核內(nèi)小分子RNA的cDNA文庫和序列測定,在粟酒裂殖酵母基因組中共發(fā)現(xiàn)了44種box C/D snoRNA的基因序列.BLAST搜索粟酒裂殖酵母基因組數(shù)據(jù)庫得知,這44種通過文庫篩到的box C/D snoRNA中,除U14,snR38和snR39已有報(bào)道外,另外13種已由其它實(shí)驗(yàn)室利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測到并在粟酒裂殖酵母基因組上進(jìn)行了注釋,其余的28種為新的snoRNA.Northern雜交結(jié)果顯示,這些snoRNA都有

2、很強(qiáng)的陽性雜交帶,其大小與預(yù)期的RNA分子相符,表明它們是粟酒裂殖酵母細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的RNA分子.逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這些snoRNA的存在.根據(jù)snoRNA的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,預(yù)測27種新的snoRNA可指導(dǎo)32個(gè)rRNA位點(diǎn)和一個(gè)U6 snRNA位點(diǎn)甲基化修飾.采用dNTP濃度依賴性引物延伸分析對部分新的snoRNA指導(dǎo)的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行鑒定,在粟酒裂殖酵母18S和25S rRNA上標(biāo)定了36個(gè)甲基化修飾的位點(diǎn).這36個(gè)位點(diǎn)中,有26

3、個(gè)在S.cerevisiae,動(dòng)物以及植物rRNA中相應(yīng)位點(diǎn)的核苷酸有被甲基化修飾,同時(shí)在S.cerevisiae,動(dòng)物以及植物中發(fā)現(xiàn)了指導(dǎo)這些位點(diǎn)2′-O-核糖甲基化修飾的反義snoRNA,其余的位點(diǎn)為粟酒裂殖酵母所特有的甲基化位點(diǎn).基因組織分析顯示,幾乎所有粟酒裂殖酵母box C/D snoRNA是由內(nèi)含子編碼的.表明粟酒裂殖酵母box C/D snoRNA的基因組織不同于釀酒酵母而與脊椎動(dòng)物非常類似.然而,與脊椎動(dòng)物不完全相同,粟

4、酒裂殖酵母內(nèi)含子編碼的snoRNA只有7個(gè)位于蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子中,其余均位于非編碼RNA基因的內(nèi)含子中或蛋白質(zhì)編碼基因3'或5'末端非翻譯區(qū)的內(nèi)含子中.在粟酒裂殖酵母snoRNA基因簇Ⅱ中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的基因結(jié)構(gòu)形式,分別編碼snR57和snR55的兩個(gè)內(nèi)含子緊密相連,中間沒有插入外顯子序列,稱為連體內(nèi)含子.RT-PCR分析和RT-PCR產(chǎn)物的斑點(diǎn)雜交結(jié)果顯示,這種連體內(nèi)含子是按順序剪接的,兩個(gè)內(nèi)含子編碼的snoRNA snR57和s

5、nR55先通過RNA剪接,然后,經(jīng)核酸酶作用去除分枝的套索結(jié)構(gòu)依次從多順反子轉(zhuǎn)錄前體釋放.比較分析不同生物的box C/D snoRNA的功能同源分子及其指導(dǎo)的甲基化位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)snoRNA基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了廣泛的重組和轉(zhuǎn)位.有些snoRNA來源于同一snoRNA分子的重復(fù)及隨后的序列變異,重復(fù)的snoRNA基因可以通過染色體重復(fù)產(chǎn)生,也可以通過內(nèi)含子的轉(zhuǎn)座產(chǎn)生.通過對粟酒裂殖酵母box C/D snoRNA的系統(tǒng)研究,我們不僅發(fā)現(xiàn)罕