粟酒裂殖酵母box H-ACA snoRNA snR90的功能分析.pdf

1、　 本論文主要將研究集中在對(duì)粟酒裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的一新種boxH/ACAsnoRNAsnR90在核糖體25S上的假尿嘧啶化修飾作用的討論。粟酒裂殖酵母核糖體大亞基上的25S是主要的肽轉(zhuǎn)移場(chǎng)所，其修飾位點(diǎn)的研究對(duì)了解粟酒裂殖酵母核糖體結(jié)構(gòu)及功能的實(shí)現(xiàn)均有極大的意義。根據(jù)對(duì)編碼snR90snoRNA的基因分析表明，snR90基因位于一個(gè)非編碼RNA基因的外顯子中，該非編碼RNA基因的內(nèi)含子中還存在一個(gè)boxC/D類snoRNA(snR80

2、)基因，是一個(gè)十分具有研究?jī)r(jià)值的基因；再對(duì)snR90的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析判斷估計(jì)該分子上應(yīng)該存在兩個(gè)假脲嘧啶化修飾位點(diǎn)。利用遺傳手段，以一個(gè)選擇性標(biāo)記基因Kanr將snR90snoRNA基因交換出來(lái)，對(duì)snR90snoRNA的基因進(jìn)行敲除(knockout)，成功構(gòu)建了基因缺失株△snR90。通過(guò)選擇培養(yǎng)基初步篩選，然后利用雙引物PCR篩選出正確重組的成功缺失株，再對(duì)野生性與缺失株中提取的總RNA分別利用Northern雜交鑒定，既確定snR

3、90snoRNA在粟酒裂殖酵母中的穩(wěn)定表達(dá)，又可進(jìn)一步確定snR90snoRNA基因缺失株△snR90的成功構(gòu)建。同時(shí)用野生株和缺失株做CMC-引物延伸實(shí)驗(yàn)，分別驗(yàn)證由snR90在核糖體25S上指導(dǎo)的假尿嘧啶化的兩個(gè)精確的修飾位點(diǎn)。最后通過(guò)用五個(gè)濃度梯度的接種量在23℃、30℃、37℃三個(gè)溫度梯度下，分別在含有抗生素G418與不含的普通培養(yǎng)基中的對(duì)比生長(zhǎng)培養(yǎng)得出缺失型菌株的生長(zhǎng)情況差異進(jìn)一步了解snR90對(duì)粟酒裂殖酵母生長(zhǎng)的影響作用。實(shí)