黑木耳核糖體失活蛋白基因的克隆.pdf

1、核糖體失活蛋白(RIP)是一類廣泛存在于植物界中的毒蛋白。由于其對(duì)人類和動(dòng)物細(xì)胞具有獨(dú)特的生物活性和對(duì)治療艾滋病、癌癥等具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，從而引起了人們極大的興趣。目前報(bào)道的RIP大多來(lái)自高等植物，在食用菌中也有一些發(fā)現(xiàn)。本文針對(duì)黑木耳中的RIP進(jìn)行了研究。 本項(xiàng)目研究是先從黑木耳菌絲體中分離得到RIP，測(cè)得其分子量為26KDa，再根據(jù)其氨基酸序列對(duì)RIP的基因進(jìn)行克隆。首先，對(duì)純化得到的RIP進(jìn)行隨機(jī)肽段的氨基酸序列測(cè)序。根

2、據(jù)測(cè)序結(jié)果，結(jié)合黑木耳密碼子的偏愛(ài)性及引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。使用cDNA 3一末端全長(zhǎng)序列擴(kuò)增試劑盒，進(jìn)行3-RACE反應(yīng)。經(jīng)過(guò)電泳、片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白篩選、質(zhì)粒提取、PCR鑒定等操作，進(jìn)行RIP cDNA 3-端序列測(cè)定。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)序列進(jìn)行分析，并設(shè)計(jì)特異性PCR巢式引物。使用cDNA 5-末端全長(zhǎng)序列擴(kuò)增試劑盒，進(jìn)行5-RACE反應(yīng)。再經(jīng)過(guò)電泳、片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白篩選、質(zhì)粒提取、PCR鑒定等操作，進(jìn)行RI