冠心病血瘀證目標(biāo)分子的鑒定、驗(yàn)證及功能分析.pdf

1、課題組前期應(yīng)用寡核苷酸基因芯片技術(shù)構(gòu)建了冠心病血瘀證白細(xì)胞差異基因表達(dá)譜,篩選出FcγRⅢA(免疫球蛋白IgG結(jié)晶片段受體Ⅲa)、PKCβ1(蛋白激酶Cβ1)、IL-8(白細(xì)胞介素-8)、HLA-DQB1(主要組織相容性復(fù)合體Ⅱβ1)、FOLR3(葉酸受體γ3)、PTGDS(前列腺素D2合成酶)6個(gè)目標(biāo)基因。運(yùn)用基因本體論和顯著性通路分析方法,從分子水平闡明了冠心病血瘀證與炎癥免疫反應(yīng)的相關(guān)性；進(jìn)一步通過Signal-Net網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,使

2、用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浼夹g(shù)分析發(fā)現(xiàn)差異基因FcγRⅢA、PKCβ1和IL-8在冠心病血瘀證疾病網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié),并對(duì)其中的目標(biāo)分子IL-8進(jìn)行了進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證和體內(nèi)、外功能分析。
　　 本課題對(duì)另外兩個(gè)目標(biāo)分子PKCβ1、FcγRⅢA進(jìn)行了鑒定、驗(yàn)證,并對(duì)FcγRⅢA在冠心病血瘀證形成中的作用進(jìn)行分析。納入冠心病血瘀證患者、冠心病非血瘀證患者和健康對(duì)照者,抽取外周血,分離白細(xì)胞,抽提總RNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real

3、-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction,Real-timeRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)分子PKCβ1、FcγRⅢA基因表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FcγRⅢAmRNA表達(dá)水平與前期基因芯片結(jié)果一致。我們進(jìn)一步從臨床血清學(xué)水平進(jìn)行了規(guī)模驗(yàn)證,并就其細(xì)胞來源進(jìn)行了相關(guān)分析；同時(shí)根據(jù)FcγRⅢA的功能,結(jié)合冠心病、血瘀證病理特點(diǎn),體外通過構(gòu)建人外周血單核細(xì)胞-臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體系,觀察FcγRⅢ

4、A對(duì)單核.內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響:體內(nèi)以ApoE-／-小鼠為研究對(duì)象,觀察FcγRⅢA高表達(dá)及抑制其表達(dá)后對(duì)小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及炎癥相關(guān)因子的影響,以期探索目標(biāo)分子FcγRⅢA參與冠心病血瘀證疾病過程的可能機(jī)制；同時(shí),觀察赤芍川芎有效部位對(duì)ApoE-／-小鼠FcγRⅢA蛋白水平、主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性以及炎癥相關(guān)因子的影響,明確活血化瘀制劑對(duì)冠心病血瘀證靶標(biāo)分子的干預(yù)效應(yīng)。
　　 本課題研究分為兩部分:文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究

5、。
　　 1文獻(xiàn)綜述:本部分分別從血瘀證與炎癥反應(yīng)、FcγR與心血管疾病研究進(jìn)展兩個(gè)方面進(jìn)行綜述。
　　 2實(shí)驗(yàn)研究:包括以下六個(gè)部分。
　　 研究一冠心病血瘀證目標(biāo)分子鑒定
　　 目的:應(yīng)用Real-timeRT-PCR技術(shù),對(duì)冠心病血瘀證目標(biāo)分子PKCβ1、FcγRⅢA進(jìn)行鑒定。
　　 方法:冠心病診斷參照1999年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)／美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA),美國(guó)醫(yī)師學(xué)會(huì)及美國(guó)內(nèi)科學(xué)會(huì)(

6、ACP-ASIM)聯(lián)合協(xié)定關(guān)于《慢性穩(wěn)定性心絞痛診療指南》、《不穩(wěn)定性心絞痛、無ST段抬高心肌梗死診療指南》。同時(shí),參考中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀專業(yè)委員會(huì)制定的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)。篩選符合冠心病、血瘀證、健康人入選標(biāo)準(zhǔn)的冠心病血瘀證組、冠心病非血瘀證組和健康對(duì)照組各20例為研究對(duì)象。冠心病血瘀證和非血瘀證患者于冠脈造影前采血,健康對(duì)照者于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血2mL,分離白細(xì)胞,抽提總RNA,應(yīng)用Real-timeRT-PCR技術(shù)檢測(cè)目

7、標(biāo)分子PKCβ1和FcγRⅢA基因表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:冠心病血瘀證組、非血瘀證組和健康對(duì)照組在年齡、性別、體重指數(shù)且兩疾病組在冠心病類型、冠脈病變支數(shù)、病程、合并疾病和用藥情況方面無顯著性差異,具有可比性。
　　 ①PKCβ1mRNA表達(dá)在冠心病血瘀證組(0.74±0.30)和非血瘀證組(0.96±0.31)均較健康對(duì)照組(1.03±0.37)降低,且冠心病血瘀證組較非血瘀證組降低顯著(P<0.05)。
　　

8、 ②FcγRⅢAmRNA表達(dá)在冠心病血瘀證組(1.37±0.50)和非血瘀證組(1.37±0.42)均較健康對(duì)照組(0.89±0.33)顯著升高(P<0.01),且冠心病血瘀證組較非血瘀證有升高趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:
　　 ①PKCβ1基因參與冠心病血瘀證過程,但與前期研究不一致,尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行鑒定。
　　 ②FcγRⅢA與冠心病血瘀證具有一定相關(guān)性,可能在冠心病血瘀證形成過程中發(fā)揮重要作用。
　　

9、 研究二FcγRⅢA血清蛋白水平以及冠心病血瘀證與動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素的相關(guān)性研究
　　 目的:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)FcγRⅢA血清水平(可溶性CD16,sCD16),驗(yàn)證其與冠心病血瘀證的臨床相關(guān)性,并分析冠心病血瘀證與動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素如血脂、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CPR)以及單核細(xì)胞參數(shù)的相關(guān)性.方法:納入冠心病血瘀證、冠心病非血瘀證患者各50例和健康對(duì)照組40例為研究對(duì)象。冠心病血瘀證和非血瘀證患者于

10、冠脈造影前采血,健康對(duì)照者于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5mL,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)血清sCD16濃度,同時(shí)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素(血脂、hs-CPR以及單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和單核細(xì)胞百分比)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果:冠心病血瘀證組、非血瘀證組和健康對(duì)照組在年齡、性別、體重指數(shù)且兩疾病組在冠心病類型、冠脈病變支數(shù)、病程和合并疾病方面無顯著性差異,具有可比性。
　　 ①血清sCD16在冠心病血瘀證組(3.67±0.98

11、U／mL)和非血瘀證組(2.80±0.80U／mL)均較健康對(duì)照組(1.58±0.47U／mL)顯著升高(P<0.01),且冠心病血瘀證組較非血瘀證組升高顯著(P<0.05)。
　　 ②總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)在冠心病血瘀證組和非血瘀證組均較健康對(duì)照組顯著升高(P<0.05或0.01),且冠心病血瘀證組較非血瘀證組有升高趨勢(shì)；而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)在冠心病血瘀證組和非血瘀證

12、組較健康對(duì)照組顯著降低(P<0.01),且冠心病血瘀證組較非血瘀證有降低趨勢(shì)。
　　 ③hs-CRP水平在冠心病血瘀證組(2.91±1.98mg／L)和非血瘀證組(1.43±1.29mg／L)均較健康對(duì)照組(0.56±0.09mg／L)顯著升高(P<0.01,0.05),且冠心病血瘀證組較非血瘀證組升高顯著(P<0.05)。
　　 ④外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)在冠心病血瘀證組、非血瘀證組和健康對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而單核細(xì)

13、胞百分比在冠心病血瘀證組(6.40±1.17％)和非血瘀證組(5.35±1.62％)均較健康對(duì)照組(4.99±1.81％)升高,且冠心病血瘀證組較非血瘀證組升高顯著(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 ①血清sCD16與冠心病血瘀證具有相關(guān)性,從蛋白水平驗(yàn)證了目標(biāo)分子FcγRⅢA與冠心病血瘀證密切相關(guān)。
　　 ②冠心病血瘀證患者與動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素,特別是hs-CRP和單核細(xì)胞百分比顯著相關(guān)。
　　

14、研究三FcγRⅢA來源分析
　　 目的:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冠心病血瘀證患者外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)以分析目標(biāo)分子FcγRⅢA來源,并分析細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1,CD54)在冠心病血瘀證患者單核細(xì)胞CD14+CD16+表面的變化,同時(shí)檢測(cè)冠心病血瘀證患者炎癥相關(guān)因子[可溶性CD14(sCD14)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)]血清水平。
　

15、　 方法:冠心病血瘀證和非血瘀證患者于冠脈造影前采血,健康對(duì)照者于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)及其表面CD54平均熒光強(qiáng)度；采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)sCD14、M-CSF、TNF-α和IL-1血清水平。
　　 結(jié)果:
　　 ①外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)在冠心病血瘀證組(11.24±7.73％)和非血瘀證組(9.96±3.66％)均較健康對(duì)照

16、組(5.64±2.49％)顯著升高(P<0.01,0.5),且冠心病血瘀證組較非血瘀證組有升高趨勢(shì)。
　　 ②外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表面CD54的平均熒光強(qiáng)度在冠心病血瘀證組(1760.60±457.60)和非血瘀證組(1089.27±426.76)均較健康對(duì)照組(849.00±100.91)顯著升高,且冠心病血瘀證組較非血瘀證組升高顯著(P<0.01)。
　　 ③炎癥相關(guān)因子sCD14、M-CSF、TNF-

17、α和IL-1血清水平在冠心病血瘀證組和非血瘀證組均較健康對(duì)照組顯著升高(P<0.01),且冠心病血瘀證組較非血瘀證組升高顯著(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 ①冠心病血瘀證患者單核細(xì)胞處于活化狀態(tài)。
　　 ②冠心病血瘀證患者高水平血清M-CSF能刺激單核細(xì)胞CD14+CD16+高表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞CD14+CD16+表面CD54表達(dá)升高并產(chǎn)生大量TNF-α和IL-1前炎癥因子,從細(xì)胞來源方面再次鑒定了目

18、標(biāo)分子FcγRⅢA與冠心病血瘀證密切相關(guān)。
　　 ③冠心病血瘀證患者體內(nèi)炎癥水平特別是單核細(xì)胞來源的細(xì)胞因子處于較高水平。
　　 研究四FcγRⅢA在人外周血單核細(xì)胞-臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附中的作用分析
　　 目的:研究FcγRⅢA對(duì)人單核細(xì)胞-臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響,對(duì)其進(jìn)行體外功能分析。
　　 方法:①分離、鑒定并培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為單核細(xì)胞(MC)組:單核細(xì)胞培養(yǎng)18h；M-CSF組:重組人

19、M-CSF刺激單核細(xì)胞培養(yǎng)18h；免疫球蛋白IgG(IVIG)組:IVIG提前干預(yù)單核細(xì)胞30min后再加重組人M-CSF刺激培養(yǎng)18h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)情況。②分離、鑒定并培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為MC組:單核細(xì)胞培養(yǎng)18h；M-CSF組:重組人M-CSF刺激單核細(xì)胞培養(yǎng)18h；IVIG組:IVIG提前干預(yù)單核細(xì)胞30min后再加重組人M-CSF刺激培養(yǎng)18h。三組細(xì)胞消化后再與臍

20、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)1h,Bradford法檢測(cè)三組單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附率。
　　 結(jié)果:瑞姬染色顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)單核細(xì)胞CD14鑒定人外周血單核細(xì)胞,倒置相差顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和Ⅷ因子相關(guān)抗原間接免疫熒光方法鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 ①經(jīng)重組人M-CSF刺激培養(yǎng)18h后單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)較未刺激前顯著升高(P<0.01)；提前給予IVIG干預(yù)30min后,單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)

21、較重組人M-CSF刺激培養(yǎng)18h顯著降低(P<0.01)。
　　 ②經(jīng)重組人M-CSF刺激培養(yǎng)18h后單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附率較單核細(xì)胞未刺激前顯著升高(P<0.05)；提前給予IVIG干預(yù)30min后,單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附率較重組人M-CSF刺激培養(yǎng)18h顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 ①重組人M-CSF在體外能刺激人外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá),IVIG能抑制該作用。
　　 ②單核

22、細(xì)胞CD14+CD16+能介導(dǎo)人外周血單核-臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附。
　　 研究五FcγRⅢA對(duì)ApoE-／-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的作用評(píng)價(jià)
　　 目的:研究目標(biāo)分子FcγRⅢA高表達(dá)和抑制其后對(duì)-ApoE-／-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的影響。
　　 方法:66只8周齡雄性ApoE-／-小鼠分為模型組:高脂飼料喂養(yǎng)10w,ApoE-／-小鼠+腹腔注射免疫球蛋白IgG組(MG組):連續(xù)腹腔注射IVIG5

23、d+高脂飼料喂養(yǎng)10w,ApoE-／-小鼠+辛伐他汀組(Sm組):Sm灌胃每日一次+高脂飼料喂養(yǎng)10w,每組各22只。與ApoE-／-小鼠具有相同遺傳背景的C57BL／6J小鼠22只作為對(duì)照組,普通飼料喂養(yǎng)10w。
　　 ①主動(dòng)脈組織病理學(xué)觀察:主動(dòng)脈根部組織石蠟切片H&E染色發(fā)現(xiàn)有動(dòng)脈粥樣硬化改變的切片進(jìn)行Masson染色評(píng)價(jià)斑塊膠原含量,α-actin和CD68免疫組化染色分別評(píng)價(jià)斑塊平滑肌細(xì)胞含量和巨噬細(xì)胞含量,主動(dòng)脈根部

24、組織冰凍切片油紅O染色評(píng)價(jià)斑塊脂肪組織含量。
　　 ②血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè):生化法檢測(cè)血脂并計(jì)算血漿致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)；雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1和sE-selectin水平。
　　 ③MMP-9基因表達(dá)和蛋白水平檢測(cè):Real-timeRT-PCR技術(shù)和Westernblot法分別檢測(cè)主動(dòng)脈MMP-9mRNA表達(dá)和蛋白水平。
　　

25、④相關(guān)性分析:外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)、主動(dòng)脈MMP-9基因表達(dá)和血清TNF-α水平在模型組、IVIG組和Sm組的相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 ①模型組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊含有大量脂質(zhì)成分、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,且膠原成分增多。IVIG能通過減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量、減少巨噬細(xì)胞聚集和平滑肌細(xì)胞增殖而發(fā)揮改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用,該作用與Sm相似。
　　 ②模型組小鼠血脂TC、TG、LDL-C水平升高

26、,HDL-C水平降低,外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+高表達(dá),血清TNF-α、IL-1和sE-selectin水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.01,0.05)；上述指標(biāo)在IVIG組有不同程度改善且作用與Sm組相似。
　　 ③模型組小鼠主動(dòng)脈MMP-9基因表達(dá)和蛋白水平均較對(duì)照組顯著升高(P<0.01),上述指標(biāo)在IVIG組有不同程度改善且作用與Sm組相似。
　　 ④相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)在

27、模型組、IVIG組和Sm組均與主動(dòng)脈MMP-9基因表達(dá)和血清TNF-α水平呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 ①FcγRⅢA介導(dǎo)主動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠炎癥相關(guān)因子釋放增加。
　　 ②FcγRⅢA一定程度上影響小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。
　　 研究六赤芍川芎有效部位對(duì)ApoE-／-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的干預(yù)效應(yīng)研究
　　 目的:研究赤芍川芎有效部位(赤芍總苷、川芎總酚)對(duì)ApoE-／-

28、小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的干預(yù)效應(yīng),并分析其可能的作用靶點(diǎn)。
　　 方法:64只8周齡雄性ApoE-／-小鼠分為模型組:高脂飼料喂養(yǎng)10w,ApoE-／-小鼠+Sm組(Sm組):Sm灌胃每日一次+高脂飼料喂養(yǎng)10w,ApoE-／-小鼠+芎芍膠囊(XSC)大劑量組(XSCH組):大劑量XSC灌胃每日一次+高脂飼料喂養(yǎng)10w和ApoE-／-小鼠+XSC小劑量(XSCL)組:小劑量XSC灌胃每日一次+高脂飼料喂養(yǎng)10w,每組各16

29、只。各組進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)、MMP-9基因表達(dá)和蛋白水平比較以及相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 ①XSC對(duì)TC、TG、LDL-C水平和AlP均有不同程度降低,同時(shí)能降低外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá),不同程度降低血清TNF-α、IL-1和sE-selectin水平,對(duì)ApoE-／-小鼠體內(nèi)炎癥水平的改善作用XSCH與Sm相似。
　　 ②XSC與Sm類似均能降低ApoE-／-小鼠主動(dòng)脈MMP-9基因表達(dá)和蛋白

30、水平,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊具有穩(wěn)定作用,但對(duì)MMP-9基因表達(dá)的降低作用XSCH較Sm顯著(P<0.05)。
　　 ③相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)XSC干預(yù)后,主動(dòng)脈MMP-9基因表達(dá)和血清TNF-α水平下降均與外周血單核細(xì)胞CD14+CD16+表達(dá)降低呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 ①赤芍川芎有效部位能減輕炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定斑塊、改善主動(dòng)脈粥樣硬化。
　　 ②赤芍川芎有效部位抗主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)與FcγR