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文檔簡介
1、脊髓損傷是一種合并全身感覺、運動功能障礙等后遺癥的嚴重損傷。隨著現(xiàn)代社會交通和建筑業(yè)的發(fā)展,該病發(fā)病率也不斷升高。嚴重的神經(jīng)功能障礙后遺癥導致患者正常生活難以自理,在精神及經(jīng)濟上給家庭和社會造成了損失。當前醫(yī)療手段對脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復尚沒有較理想的效果。膠質瘢痕是影響脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生和功能恢復的重要因素。目前常見的抑制膠質瘢痕形成的方法有:抑制SCI后星形膠質細胞分裂增殖;采用藥物裂解CSPG;抑制CSPG表達;基因技術封閉
2、GFAP、Vim表達;X線放射治療抑制膠質瘢痕;抑制SCI后炎癥反應;手術切除膠質瘢痕等。轉錄因子Nrf2在多種疾病模型中可抑制炎癥反應,如自身免疫疾病、哮喘、肺氣腫、風濕性關節(jié)炎、結腸炎、動脈粥樣硬化等。NF-κb是調控炎癥反應的主要轉錄因子。Nrf2主要通過抑制NF-κb活性,降低各種前炎癥介質如基質金屬蛋白酶、炎癥趨化因子、細胞粘附分子等表達發(fā)揮抗炎作用。Nrf2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有明顯的神經(jīng)保護作用,其激活后可在神經(jīng)退行性疾病、
3、腦缺血梗死、腦出血、顱腦創(chuàng)傷等疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此我們推測,Nrf2可能通過調控NF-κb信號通路抑制SCI后炎癥反應而抑制膠質瘢痕形成,為此我們設計了本實驗研究。
目的:
在實驗中,我們選用ICR小鼠(Nrf2+/+、Nrf2-/-),建立小鼠脊髓損傷模型,通過采用Nrf2激活劑SFN和基因敲除對Nrf2進行正反向調控,觀測Nrf2在SCI中對NF-κb信號通路、膠質瘢痕形成、神經(jīng)功能恢復的影響,探討Nrf
4、2對SCI后膠質瘢痕形成的影響及作用機制。
方法:
選用ICR小鼠(Nrf2+/+、Nrf2-/-),建立小鼠脊髓損傷模型,給予Nrf2激活劑SFN干預,給藥方法:將SFN以玉米油稀釋,建模后即給藥,腹腔注射,5mg/kg/d,共累計7次給藥,溶劑對照組等體積玉米油腹腔注射。設計6個實驗分組,分別為野生型假手術組、野生型單純損傷組、野生型溶劑干預組(等體積玉米油腹腔注射)、野生型 SFN干預組(5mg/kg/d,腹腔
5、注射)、Nrf2敲除假手術組、Nrf2敲除損傷組。術后1d、7d、14 d、21 d、28 d對各組小鼠進行BMS評分;術后7d行免疫熒光雙標染色(GFAP+Nrf2、GFAP+Vim、GFAP+P65、GFAP+CSPG)觀察脊髓組織病理變化;術后7d WB檢測各組Nrf2、P65、p-Iκ Bα、GFAP、Vim、CSPG蛋白表達情況,ELISA檢測TNF-α、IL-1β蛋白表達情況,Real-time PCR檢測TNF-α、IL-
6、1β mRNA相對含量;術后28d WB檢測GFAP、CSPG、GAP-43蛋白表達情況。
結果:
行為學:假手術組BMS評分均為9分,各脊髓損傷組術后后肢運動功能均有不同程度恢復,術后28d時單純損傷組評分為2.17±0.41分,玉米油組2.33±0.52分,SFN組3.33±0.52分,Nrf2敲除損傷組1.50±0.54分,SFN組功能恢復情況最好,玉米油組與單純損傷組次之,而Nrf2敲除損傷組恢復情況最差,玉
7、米油組與單純損傷組之間無顯著差異,其余各組之間比較差異明顯(P<0.05)。
免疫熒光染色:術后7d,SFN組與單純損傷組相比,Nrf2核移位增加,P65核移位減少,同時星形膠質細胞活化水平降低,GFAP、Vim、CSPG染色較弱;Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比,Nrf2染色不明顯,P65核移位增加,星形膠質細胞活化水平明顯增強,GFAP、Vim、CSPG染色增強;單純損傷組與玉米油組無明顯差異。
WB檢測相關蛋
8、白表達情況:術后7d,SFN組與單純損傷組相比,Nrf2(核蛋白)表達增加,P65(核蛋白)降低,p-IκBα、GFAP、Vim、CSPG降低;Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比,P65(核蛋白)增加,p-IκBα、GFAP、Vim、CSPG增加;術后28d,SFN組與單純損傷組相比,GFAP、CSPG降低,GAP-43增加,Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比,GFAP、CSPG增加,GAP-43降低;單純損傷組與玉米油組無明顯差異。<
9、br> ELISA檢測TNF-α、IL-1β蛋白表達情況:術后7d,SFN組與單純損傷組相比,TNF-α、IL-1β蛋白表達降低,Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比,TNF-α、IL-1β蛋白表達增加;單純損傷組與玉米油組無明顯差異。
RT-PCR檢測TNF-α、IL-1β mRNA相對含量:術后7d,SFN組與單純損傷組相比, TNF-α、IL-1β mRNA表達降低,Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比,TNF-α、IL-
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