Nrf2對小鼠脊髓損傷后膠質瘢痕形成的影響及機制研究.pdf

1、脊髓損傷是一種合并全身感覺、運動功能障礙等后遺癥的嚴重損傷。隨著現(xiàn)代社會交通和建筑業(yè)的發(fā)展，該病發(fā)病率也不斷升高。嚴重的神經(jīng)功能障礙后遺癥導致患者正常生活難以自理，在精神及經(jīng)濟上給家庭和社會造成了損失。當前醫(yī)療手段對脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復尚沒有較理想的效果。膠質瘢痕是影響脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生和功能恢復的重要因素。目前常見的抑制膠質瘢痕形成的方法有:抑制SCI后星形膠質細胞分裂增殖;采用藥物裂解CSPG;抑制CSPG表達;基因技術封閉

2、GFAP、Vim表達;X線放射治療抑制膠質瘢痕;抑制SCI后炎癥反應;手術切除膠質瘢痕等。轉錄因子Nrf2在多種疾病模型中可抑制炎癥反應，如自身免疫疾病、哮喘、肺氣腫、風濕性關節(jié)炎、結腸炎、動脈粥樣硬化等。NF-κb是調控炎癥反應的主要轉錄因子。Nrf2主要通過抑制NF-κb活性，降低各種前炎癥介質如基質金屬蛋白酶、炎癥趨化因子、細胞粘附分子等表達發(fā)揮抗炎作用。Nrf2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有明顯的神經(jīng)保護作用，其激活后可在神經(jīng)退行性疾病、

3、腦缺血梗死、腦出血、顱腦創(chuàng)傷等疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此我們推測，Nrf2可能通過調控NF-κb信號通路抑制SCI后炎癥反應而抑制膠質瘢痕形成，為此我們設計了本實驗研究。
　　目的:
　　在實驗中，我們選用ICR小鼠(Nrf2+/+、Nrf2-/-)，建立小鼠脊髓損傷模型，通過采用Nrf2激活劑SFN和基因敲除對Nrf2進行正反向調控，觀測Nrf2在SCI中對NF-κb信號通路、膠質瘢痕形成、神經(jīng)功能恢復的影響，探討Nrf

4、2對SCI后膠質瘢痕形成的影響及作用機制。
　　方法:
　　選用ICR小鼠(Nrf2+/+、Nrf2-/-)，建立小鼠脊髓損傷模型，給予Nrf2激活劑SFN干預，給藥方法:將SFN以玉米油稀釋，建模后即給藥，腹腔注射，5mg/kg/d，共累計7次給藥，溶劑對照組等體積玉米油腹腔注射。設計6個實驗分組，分別為野生型假手術組、野生型單純損傷組、野生型溶劑干預組（等體積玉米油腹腔注射）、野生型 SFN干預組(5mg/kg/d，腹腔

5、注射)、Nrf2敲除假手術組、Nrf2敲除損傷組。術后1d、7d、14 d、21 d、28 d對各組小鼠進行BMS評分;術后7d行免疫熒光雙標染色(GFAP+Nrf2、GFAP+Vim、GFAP+P65、GFAP+CSPG)觀察脊髓組織病理變化;術后7d WB檢測各組Nrf2、P65、p-Iκ Bα、GFAP、Vim、CSPG蛋白表達情況，ELISA檢測TNF-α、IL-1β蛋白表達情況，Real-time PCR檢測TNF-α、IL-

6、1β mRNA相對含量;術后28d WB檢測GFAP、CSPG、GAP-43蛋白表達情況。
　　結果:
　　行為學:假手術組BMS評分均為9分，各脊髓損傷組術后后肢運動功能均有不同程度恢復，術后28d時單純損傷組評分為2.17±0.41分，玉米油組2.33±0.52分，SFN組3.33±0.52分，Nrf2敲除損傷組1.50±0.54分，SFN組功能恢復情況最好，玉米油組與單純損傷組次之，而Nrf2敲除損傷組恢復情況最差，玉

7、米油組與單純損傷組之間無顯著差異，其余各組之間比較差異明顯(P＜0.05)。
　　免疫熒光染色:術后7d，SFN組與單純損傷組相比，Nrf2核移位增加，P65核移位減少，同時星形膠質細胞活化水平降低，GFAP、Vim、CSPG染色較弱;Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比，Nrf2染色不明顯，P65核移位增加，星形膠質細胞活化水平明顯增強，GFAP、Vim、CSPG染色增強;單純損傷組與玉米油組無明顯差異。
　　WB檢測相關蛋

8、白表達情況:術后7d，SFN組與單純損傷組相比，Nrf2（核蛋白）表達增加，P65(核蛋白)降低，p-IκBα、GFAP、Vim、CSPG降低;Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比，P65(核蛋白)增加，p-IκBα、GFAP、Vim、CSPG增加;術后28d，SFN組與單純損傷組相比，GFAP、CSPG降低，GAP-43增加，Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比，GFAP、CSPG增加，GAP-43降低;單純損傷組與玉米油組無明顯差異。<

9、br>　　ELISA檢測TNF-α、IL-1β蛋白表達情況:術后7d，SFN組與單純損傷組相比，TNF-α、IL-1β蛋白表達降低，Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比，TNF-α、IL-1β蛋白表達增加;單純損傷組與玉米油組無明顯差異。
　　RT-PCR檢測TNF-α、IL-1β mRNA相對含量:術后7d，SFN組與單純損傷組相比， TNF-α、IL-1β mRNA表達降低，Nrf2敲除損傷組與單純損傷組相比，TNF-α、IL-