姜黃素對大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的干預作用及其機制研究.pdf

1、脊髓損傷(spinAlcord injury，SCI)發(fā)生率高，危害嚴重。迄今為止還沒有針對脊髓損傷確定性的治療方法，其重要原因是損傷機制不十分清楚。
　　 中樞神經(jīng)損傷(CentrAlnervous system，CNS)后有意義的神經(jīng)束再生失敗的重要原因是由反應性膠質(zhì)化導致的膠質(zhì)瘢痕的形成。反應性膠質(zhì)化(gliosis)或稱反應性膠質(zhì)增生，是一個復雜修復反應，主要包括星形膠質(zhì)細胞在創(chuàng)傷后被激活，以GFAP、Vim為標志的中間

2、絲蛋白表達上調(diào)，細胞肥大增生，最終形成膠質(zhì)瘢痕。損傷部位幾乎所有類型的細胞(尤其是星形膠質(zhì)細胞)都可以分泌抑制性細胞外基質(zhì)中的主要成分CSPGs。反應性膠質(zhì)化所構(gòu)成的致密網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)可以作為物理性屏障在空間上封閉生長錐的前進；而CSPGs 則成為抑制軸突出芽的化學性屏障。故而，膠質(zhì)瘢痕形成被視為抑制軸突再生最主要的障礙。如何有效抑制膠質(zhì)瘢痕形成，具有重要意義。甲基強的松龍曾被廣泛應用于臨床治療脊髓損傷，近來因其有效性和不良反應受到質(zhì)疑。

3、r>　　 姜黃提取自姜科姜黃屬多年生草本植物姜黃(Curcuma Longa L.)干燥梗莖中，因其具有多種藥理學特性如抗氧化、抗炎癥、抗菌、抗病毒、抗真菌而且安全，無毒被廣泛應用于癌癥、代謝性疾病、動脈粥樣硬化、自身免疫疾病、糖尿病等的臨床治療。
　　 此外，由于姜黃素具有顯著的安全性并具有多向神經(jīng)保護潛能而被應用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在包括阿爾茨海默病，遲發(fā)性運動障礙，嚴重抑郁，癲癇和其他相關(guān)的神經(jīng)變性和神經(jīng)精神疾病的實驗

4、研究中被證實有效。
　　 由于脊髓損傷是突發(fā)機械性創(chuàng)傷導致的出血、組織壞死，原發(fā)損傷及繼發(fā)損傷多種相關(guān)的病理生理改變恰好與姜黃素的抗氧化、抗纖維化、抗炎、抗膠質(zhì)細胞等特性相契合。因此，我們將姜黃素作為干預措施，觀察其對預防和治療脊髓損傷的功效。
　　 通過建立實驗性大鼠脊髓損傷模型，給予姜黃素預處理、甲基強的松龍干預治療及單純脊髓損傷大鼠作對比，通過受損脊髓組織形態(tài)學、免疫組織化學、運動學功能評分評價姜黃素對SCI的治療

5、作用，采用免疫組織化學、RT-PCR、免疫蛋白印跡方法檢測姜黃素對于損傷后GFAP、Vim、CSPGs表達的影響，Elisa 法檢測脊髓損傷后早期前炎癥細胞因子的變化觀察了不同濃度姜黃素對大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的作用，對GFAP、Vim和CSPGs表達的影響和炎癥反應的作用，初步探討了姜黃素對大鼠脊髓損傷的影響及其可能作用機制以期為臨床急性脊髓損傷的治療提供實驗依據(jù)。
　　 目的
　　 通過研究姜黃素對大鼠SCI后脊

6、髓組織病理改變、膠質(zhì)瘢痕形成、神經(jīng)功能恢復情況、早期炎癥反應的作用，探討姜黃素對脊髓損傷的保護作用及其可能的機制。
　　 方法
　　 構(gòu)建大鼠模型：288只Wistar大鼠隨機分為6組①單純損傷組②姜黃素預處理組(術(shù)前30min，300mg/kg，I.p.)③-⑤姜黃素治療(大300mg/kg、中100mg/kg、小劑量30mg/kg，I.p.)組和⑥甲強龍治療組(30mg/kg，I.v.)。以50g 力的動脈瘤夾鉗夾胸

7、T9-10段脊髓1分鐘制造脊髓鉗夾損傷模型并按計劃給藥。傷后1d，1-8w 每周行Basso BeattieBresnahan(BBB)評分及斜板試驗，術(shù)后2w、8w大鼠，HE 染色觀察脊髓組織病理變化，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應RT-PCR 檢測各組GFAP mRNA、Vim mRNA 相對含量的變化，免疫組化法和Western blot 檢測GFAP、CSPGs蛋白的表達差異。Elisa 法檢測SCI后1h、3h、6h、12h、24h、7

8、2h 各個時間點的前炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κ B、TGF-β1、TGF-β2、SOX-9表達變化。
　　 結(jié)果
　　 建立了大鼠脊髓鉗夾損傷模型，以50g 力的動脈瘤夾鉗夾T9-10胸段脊髓1min造模，SCI后大鼠呈現(xiàn)典型的截癱癥狀；
　　 1、病理學
　　 大體標本觀察到SCI后8w，姜黃素治療各組損傷處脊髓縮窄、粘連減輕。
　　 HE 染色顯示SCI后2w，用姜

9、黃素治療后，相比于單純損傷組和甲強龍組，脊髓形態(tài)較為完整，神經(jīng)元固縮、溶解、壞死減輕，炎癥反應較輕，姜黃素預處理組組織損害輕于甲強龍組；SCI后8w，用姜黃素治療后，脊髓組織結(jié)構(gòu)較為清晰，更多正常的神經(jīng)元，膠質(zhì)瘢痕較規(guī)則，組織空洞小于單純損傷組(P<0.05)，姜黃素預處理組也較單純損傷組空洞范圍小。提示姜黃素可以減少脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成及縮小空洞，有助于再生的軸突穿越膠質(zhì)瘢痕到達損傷區(qū)的遠側(cè)端，建立新的神經(jīng)通路和功能聯(lián)系。
　

10、　 2、免疫組織化學染色顯示SCI后2w、8w 姜黃素治療組、姜黃素預處理組、甲強龍組損傷中心區(qū)邊緣GFAP、CSPGs 染色均不同程度減弱，表達降低，瘢痕、空洞縮小，其中，姜黃素治療組隨劑量增大，抑制效果越趨明顯，而姜黃素預處理組則優(yōu)于甲強龍組。說明姜黃素可以抑制脊髓損傷后GFAP、CSPGs表達，削弱膠質(zhì)瘢痕、囊腔空洞及其中的抑制性因子的物理、化學屏障作用，有利于軸突的再生。
　　 3、RT-PCR 結(jié)果顯示姜黃素治療、姜

11、黃素預處理以及甲強龍治療脊髓損傷后2w、8w大鼠脊髓損傷段GFAP mRNA、Vim mRNA表達相比于單純損傷組均有所降低。而姜黃素治療組中隨劑量增加療效增強，姜黃素預處理組比甲強龍組抑制作用明顯。說明脊髓損傷后應用姜黃素治療能抑制損傷區(qū)周圍脊髓組織GFAP mRNA、Vim mRNA表達的增加。
　　 4、Western blot 檢測均提示2w、8w 各組GFAP和CSPGs蛋白的表達上調(diào)，姜黃素治療后的表達明顯弱于單純損

12、傷組大鼠，大劑量組最明顯，姜黃素預處理組也可抑制GFAP和CSPGs的升高。
　　 5、行為學
　　 后肢運動評分顯示脊髓損傷后完全性后肢癱瘓的各組大鼠逐漸恢復運動功能，姜黃素各組2、8w的行為功能均顯著優(yōu)于單純損傷組和甲強龍治療組，大劑量組效果最好(P<0.05)，姜黃素預處理組在術(shù)后4w 起也較單純損傷組表現(xiàn)出更好的行為學功能。
　　 6、Elisa 結(jié)果顯示脊髓損傷后組織中檢測的各前炎癥細胞因子在傷后1h

13、開始升高，至12h 達峰值，而后逐漸減弱，持續(xù)降低至損傷后72h(觀察最后時間點)，各個時間點姜黃素大劑量組、中劑量組表達均低于單純損傷組，而高于甲強龍組。姜黃素預處理組在對各前炎癥細胞因子的檢測中未表現(xiàn)出與其他組有明顯的含量差別。提示大、中劑量姜黃素能不同程度的抑制SCI 急性期各種炎癥因子的表達。
　　 結(jié)論
　　 1、姜黃素能夠促進SCI后大鼠后肢運動功能的恢復；可以抑制損傷部位中間絲蛋白標志物GFAP、Vim的生

14、成，并抑制性細胞外基質(zhì)成分CSPGs的表達，減弱星形膠質(zhì)細胞的反應性膠質(zhì)化，減少膠質(zhì)瘢痕形成及縮小空洞，削弱了因膠質(zhì)瘢痕形成給軸突再生造成的物理、化學屏障，姜黃素可以抑制各組前炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6、NF-κ B、TNF-α、SOX-9、TGF-β1及TGF-β2)的表達，抑制炎癥反應，改善SCI 傷后局部的微環(huán)境，起到保護神經(jīng)細胞的作用；這種保護作用可能是與減輕炎癥反應，進而減輕膠質(zhì)瘢痕形成有關(guān)。
　　 2、姜黃素