阻滯NRF2后砷對NRF2抑制因子的影響及與MAPK基因關系.pdf

1、目的：NRF2基因抑制的人角質形成細胞株HaCaT細胞為模型細胞，阻滯NRF2對NRF2抑制因子的影響及與MAPK基因關系，為砷致皮膚毒性機制提供理論依據。
　　方法：1、NRF2 shRNA的構建：以人源NRF2基因為靶基因，設計與NRF2基因具有特異性的小干擾RNA，構建其shRNA，重組慢病毒表達載體，并進行測序鑒定。2、慢病毒包裝：用重組后表達成功的載體轉染并包裝細胞293T，收集、濃縮病毒上清液、測定其滴度。3、抑制NR

2、F2基因的Hacat細胞模型的構建，構建好的三種慢病毒分別感染HaCaT細胞（MOI=5）,感染48小時后，用1μg/ml的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株。4、穩(wěn)定細胞株的鑒定：篩選出穩(wěn)定的細胞株后，用實時熒光定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)檢測干擾效率。5、細胞培養(yǎng)與砷處理：所用細胞均按細胞常規(guī)培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。6、MTT法檢測細胞生長狀況，確定砷處理濃度，砷處理濃度別為以毒理學標準的LC50的1/100、1

3、/50、1/10。7、流式細胞儀檢測細胞活性氧。8、實時熒光定量PCR檢測細胞中Nrf2、KEAP1、N6AMT1、Bach1、MAPK/ERK mRNA的表達水平。9、ELISA法檢測細胞中GSH、N6AMT1、COX-2的蛋白表達水平。
　　結果：1、慢病毒干擾載體構建測序結果顯示重組載體構建成功。2、慢病毒滴度測試結果：依據滴度（TU/ml）=細胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)×103選取最佳滴度的病毒。3、選取NR

4、F2 shRNA3 Hacat細胞，其基因的抑制效率為87％。4、砷處理低、中、高劑量組分別為2.10μmol/L、4.20μmol/L、21.00μmol/L，抑制Nrf2、抑制Keap1、空白對照組砷處理濃度為0μmol/L。5、細胞增殖：2.10μmol/L砷處理細胞，細胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象；4.20μmol/L砷處理細胞在72h開始出抑制；21.00μmol/L砷處理細胞48h開始明顯抑制細胞。空白組細胞增值率略低于抑制Keap1對照

5、組，高于抑制Nrf2對照組。6、活性氧（ROS）在空白組表達較高隨時間變化趨向穩(wěn)定，抑制Keap1基因ROS表達上調，抑制Nrf2基因ROS降低，砷處理后ROS下調。7、2.10μmol/L、4.2μmol/L砷處理抑制Nrf2基因的細胞8h、24h后促進Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA的表達；21.00μmol/L砷處理72h可使抑制Nrf2基因的細胞中Bach1、N6AMT1、MAPK/ERK mRNA表達下調，

6、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。8、2.10μmol/L、24h砷處理的抑制NRF2基因的HaCaT細胞能使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表達上調；72h、29.00μmol/L砷處理抑制NRF2基因的HaCaT細胞使N6AMT1、COX-2、GSH蛋白的表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；
　　結論：1、砷具有低促效應。2、N6AMT1能夠調控氧化與抗氧化水平。3、GSH調節(jié)細胞氧化水平。4、ROS在體內有維