人胰島淀粉樣多肽損傷大鼠海馬神經(jīng)元的機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）與二型糖尿?。╰ypeⅡdiabetes mellitus, DM2）是兩種常見的年齡相關(guān)性疾病。二者具有相似的流行病學(xué)及生物化學(xué)特征，且均與蛋白質(zhì)聚集，最終形成纖維狀結(jié)構(gòu)有關(guān)——胰島淀粉樣多肽（Amylin）聚集于DM2的胰腺組織，β淀粉樣蛋白（Aβ）聚集于AD的腦組織。大量研究表明，兩種疾病具有明顯的相關(guān)性。Amylin寡聚體在腦內(nèi)的出現(xiàn)被認(rèn)為是導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的新危險因素

2、。雖然Amylin已被證實，其聚集過程可改變內(nèi)鈣（[Ca2+]i）穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而損傷胰島β細(xì)胞，但其神經(jīng)毒性機(jī)制仍不清楚。本文中，我們應(yīng)用離子成像、全細(xì)胞膜片鉗及免疫熒光等技術(shù)，探究Amylin對大鼠海馬神經(jīng)元的損傷機(jī)制。
　　大量報道指出，Aβ蛋白在細(xì)胞膜表面形成寡聚體的過程中，可以產(chǎn)生大量的ROS，從而破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。我們猜想高濃度hAmylin對神經(jīng)元的損傷機(jī)制可能與之相似。因此，我們借助免疫熒光、活細(xì)胞工作站及掃描電鏡，進(jìn)

3、一步探究hAmylin對神經(jīng)元細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響。
　　第一部分：胰島淀粉樣多肽對大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣的影響
　　目的：分析不同來源、不同濃度的Amylin對原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的影響及其機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)元純度，及相關(guān)受體表達(dá)。利用鈣成像技術(shù)記錄神經(jīng)元[Ca2+]i變化。利用免疫熒光觀察Amylin受體的表達(dá)量。利用透射電鏡觀察Amylin的聚集狀態(tài)。

4、
　　結(jié)果：
　　1.原代海馬神經(jīng)元純度鑒定
　　神經(jīng)元細(xì)胞純度>98％
　　2.Amylin對原代海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的影響
　　應(yīng)用不同濃度的hAmylin對原代大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)1-30μM的hAmylin可誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca2+]i顯著增加（P<0.05）。神經(jīng)元對3μM和10μM hAmylin的反應(yīng)率分別為38.46%和55.05%。10μM hAmylin可使R(340/380)增

5、長67.6±17.5%，EC50約等于2.53μM。海馬神經(jīng)元[Ca2+]i在給予10μM hAmylin約10 s后達(dá)峰，且可維持在峰值，無衰減。在撤藥洗脫后約30 s，[Ca2+]i可恢復(fù)至基線。重復(fù)給藥[Ca2+]i增加的峰值未見明顯變化（P>0.05），說明沒有藥物脫敏現(xiàn)象。
　　大約10%的神經(jīng)元在給予10μM鼠來源的Amylin（rAmylin）及普蘭林泰（hAmylin類似物，不發(fā)生聚集）后，產(chǎn)生[Ca2+]i增加現(xiàn)

6、象。R(340/380)增長分別為22.1±4.0%和24.8±7.0%，與應(yīng)用10μM hAmylin相比，反應(yīng)顯著降低（P<0.001）。
　　10μM Amylin受體抑制劑AC187或AC253本身并不影響神經(jīng)元[Ca2+]i，但可阻斷1μM hAmylin、10μM普蘭林泰及10μM rAmylin的作用，而10μM hAmylin所導(dǎo)致的[Ca2+]i增加現(xiàn)象不受影響。說明低濃度（1μM）hAmylin、10μM普蘭林

7、泰及10μM rAmylin所引起的[Ca2+]i增加現(xiàn)象是一種受體依賴的機(jī)制，而高濃度（10μM）hAmylin所引起的內(nèi)鈣增加現(xiàn)象是一種非受體依賴的機(jī)制。
　　3.Amylin受體RAMP在胎鼠海馬神經(jīng)元及成年大鼠腦片海馬區(qū)的表達(dá)
　　應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)Amylin受體RAMP1、2亞型在胎鼠海馬神經(jīng)元及大鼠腦片海馬區(qū)均有高表達(dá)。RAMP3亞型僅在胎鼠海馬神經(jīng)元高表達(dá)，而成年大鼠腦片海馬區(qū)表達(dá)量較低。
　　

8、4.濃度對hAmylin聚集的影響
　　我們推測高濃度（10μM）hAmylin所誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加與hAmylin的聚集有關(guān)。因此，我們應(yīng)用透射電鏡對hAmylin的聚集狀態(tài)進(jìn)行觀察。高濃度hAmylin（10μM）在37℃孵育1 h和24 h后，分別觀察到寡聚體及纖維狀結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。而在低濃度hAmylin（1μM）溶液中并未觀察到類似結(jié)構(gòu)。說明hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的非受體依賴機(jī)制，可能與其在高濃度下更容易

9、出現(xiàn)錯誤折疊，產(chǎn)生寡聚體及纖維狀結(jié)構(gòu)的特性有關(guān)。
　　第二部分：人胰島淀粉樣多肽對TRPV4的興奮性調(diào)節(jié)作用
　　目的：探究高濃度hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca2+]i增加的非受體依賴機(jī)制
　　方法：培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元，利用鈣成像技術(shù)記錄神經(jīng)元[Ca2+]i變化，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞靜息電位。利用scRT-PCR，及siRNA技術(shù)探究TRPV4在hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加反應(yīng)中的作用。

10、　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)細(xì)胞膜鈣通透性離子通道與hAmylin誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加
　　細(xì)胞[Ca2+]i增加的來源只能是胞外鈣內(nèi)流或（和）胞內(nèi)鈣庫釋放。為探究hAmylin所誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加是否來源于外鈣。我們使用了無鈣細(xì)胞外液，并加入0.1 mM EGTA鰲合殘存的外鈣。在無鈣外液中，10μM hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的現(xiàn)象消失。說明細(xì)胞膜上的鈣離子通道在hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的現(xiàn)象

11、中扮演重要角色。
　　為進(jìn)一步排除胞內(nèi)鈣庫釋放對該現(xiàn)象的影響，我們給予5μM環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid, CPA）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶抑制劑，孵育1 min后，引起神經(jīng)元[Ca2+]i增加。隨后，再次給予hAmylin仍可引起神經(jīng)元[Ca2+]i的快速增加，且增加程度與不應(yīng)用CPA相比無明顯變化（P>0.05）。用1μM毒胡蘿卜素（thapsigargin, TG）替代CPA，重復(fù)該實驗得到相同結(jié)果。說明增加的[

12、Ca2+]i主要來源于胞外鈣內(nèi)流，而非胞內(nèi)鈣庫釋放。
　　2.電壓門控性鈣離子通道與hAmylin誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i增加
　　我們利用膜片鉗技術(shù)檢測hAmylin對神經(jīng)細(xì)胞膜靜息電位的影響。我們發(fā)現(xiàn)在給予hAmylin后，細(xì)胞膜靜息電位由-55.67±2.35mV上升至-35.00±2.80 mV。個別細(xì)胞還觀察到動作電位的產(chǎn)生?？紤]到細(xì)胞膜靜息電位去極化至-40 mV時，即可激活L型鈣通道。因此我們認(rèn)為hAmyl

13、in誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的現(xiàn)象有電壓門控性鈣離子通道參與。
　　我們給予L型鈣通道阻斷劑氨氯地平（5μM）或N型鈣通道阻斷劑芋螺霉素（1μM）孵育1 min后，hAmylin誘導(dǎo)的R(340/380)增加率分別為44.49±13.84%和52.84±13.23%，與單獨應(yīng)用 hAmylin（67.98±14.85%）相比，有明顯差異（P<0.01）。說明電壓門控性鈣離子通道參與了hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca2+]i增加。然而，

14、即便在同時給予氨氯地平和芋螺霉素時，仍不能完全抑制hAmylin的作用，提示仍有其他的鈣通透性通道參與該反應(yīng)。
　　3.hAmylin誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i增加依賴于外鈉參與
　　為探究hAmylin導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜去極化的機(jī)制，我們用NMDG（一種不透過陽離子通道的大體積有機(jī)陽離子）代替了細(xì)胞外液中的Na+。在無鈉外液中，hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的現(xiàn)象被顯著抑制。反應(yīng)陽性率降至18.2%，反應(yīng)強度由65.3

15、9±15.91%降至34.34±4.57%（P<0.001）。說明hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加依賴于外鈉內(nèi)流，進(jìn)而使細(xì)胞膜去極化，膜靜息電位抬高。有趣的是，當(dāng)我們在正常外液中加入TTX（1μM）后，hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的現(xiàn)象無明顯變化（P>0.05），說明電壓門控性鈉離子通道并不參與該反應(yīng)。甚至在無鈉外液中加入氨氯地平，仍然無法完全阻斷hAmylin誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加現(xiàn)象。因此我們考慮，可能有非選擇性陽離子

16、通道（如TRP家族）于上游進(jìn)行調(diào)控。
　　4.TRPV4參與hAmylin誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i增加
　　我們在給予TRP通道廣譜抑制劑RR（10μM）后，hAmylin誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i增加的現(xiàn)象被顯著抑制（P<0.01）。靜息電位抬高了8.8±1.1 mV，與單獨應(yīng)用hAmylin（21.4±1.7 mV）相比，有顯著差異（P<0.001）。
　　為進(jìn)一步探究參與反應(yīng)的是TRP家族中的哪一種亞型，我

17、們應(yīng)用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)檢測hAmylin反應(yīng)陽性的海馬神經(jīng)元。發(fā)現(xiàn)6/7的陽性海馬神經(jīng)元表達(dá)TRPV4亞型，這與胰島β細(xì)胞的結(jié)果一致。之后，我們使用TRPV4通道的選擇性抑制劑HC067047（1μM）進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca2+]i增加的現(xiàn)象被顯著抑制（P<0.01）。靜息電位抬高7.4±1.1 mV，與單獨應(yīng)用hAmylin（21.4±1.7 mV）相比，有顯著差異（P<0.001）。
　　在成年SD

18、大鼠的腦切片中，TRPV4在海馬區(qū)的表達(dá)很低，這與之前報道相一致。然而，在原代培養(yǎng)的SD大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元中，TRPV4在部分神經(jīng)元中表達(dá)，陽性率為54%，這與鈣成像hAmylin反應(yīng)陽性率相一致。
　　為進(jìn)一步確證TRPV4參與hAmylin誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加，我們應(yīng)用TRPV4通道激動劑（GSK1016790A,100 nM）對海馬神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù)。我們發(fā)現(xiàn)GSK1016790A與hAmylin誘導(dǎo)細(xì)胞[Ca2+]i增加的

19、現(xiàn)象總是相伴出現(xiàn)在同一神經(jīng)細(xì)胞。hAmylin的反應(yīng)低于GSK1016790A。我們利用siRNA技術(shù)將TRPV4通道敲低后，GSK1016790A及hAmylin誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加較未敲低組顯著降低（P<0.05）。說明TRPV4通道是hAmylin誘導(dǎo)神經(jīng)元[Ca2+]i增加上游反應(yīng)的關(guān)鍵靶點，這一結(jié)果與胰島β細(xì)胞的研究一致。
　　為探究hAmylin是否可以直接激活TRPV4通道，我們對轉(zhuǎn)染TRPV4通道的HEK293

20、細(xì)胞，直接給予GSK1016790A（100 nM）與hAmylin。發(fā)現(xiàn)GSK1016790A誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的反應(yīng)仍然存在，而hAmylin誘導(dǎo)[Ca2+]i增加的反應(yīng)消失。說明hAmylin并非直接激活TRPV4通道，或其需要某些因素共同參與時才可激活該通道。
　　第三部分：人胰島淀粉樣多肽對細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響
　　目的：探究hAmylin激活TRPV4的機(jī)制
　　方法：培養(yǎng)原代大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元，應(yīng)用離子

21、成像技術(shù)記錄神經(jīng)元[Ca2+]i變化，線粒體膜電位的變化及ROS的生成。利用免疫熒光、活細(xì)胞工作站、掃描電鏡觀察hAmylin對細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.hAmylin聚集狀態(tài)的觀察
　　我們將N端標(biāo)記FAM熒光的hAmylin加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃孵育15 min后，更換培養(yǎng)基，可觀察到聚合的hAmylin熒光。用新鮮培養(yǎng)基進(jìn)一步搖床洗脫之后，熒光消失。說明hAmylin更容易在細(xì)胞表面發(fā)生聚集，而

22、沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。為分析hAmylin的聚合過程是否可逆，我們在更換培養(yǎng)基后，持續(xù)觀察聚合的hAmylin熒光12 h，熒光并未減少。說明hAmylin聚合的過程是不可逆的。
　　2.hAmylin長時間作用對神經(jīng)元形態(tài)的影響
　　我們利用活細(xì)胞工作站，對高濃度（10μM）hAmylin作用下的神經(jīng)元形態(tài)進(jìn)行長時間觀察。10μM hAmylin作用約4 h后，神經(jīng)元開始出現(xiàn)核固縮；約9h后，可觀察到細(xì)胞凋亡。
　

23、　3.hAmylin對海馬組織的直接影響
　　為了觀察hAmylin對海馬組織的直接影響，我們給成年大鼠側(cè)腦室注射5μL的10μM hAmylin，并于24 h后處死取腦，行冰凍切片。利用免疫熒光染色技術(shù)，我們觀察到hAmylin導(dǎo)致的海馬區(qū)神經(jīng)元缺失。在我們的實驗中，并未觀察到明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，說明炎癥反應(yīng)并非造成神經(jīng)元缺失的主要原因。
　　4.hAmylin對細(xì)胞膜完整性的影響
　　我們猜想hAmylin誘導(dǎo)神

24、經(jīng)元[Ca2+]i增加可能與其寡聚體能在細(xì)胞膜表面形成非選擇性離子通透性孔道有關(guān)。我們對HEK293細(xì)胞給予10μM hAmylin1 min，并未觀察到細(xì)胞[Ca2+]i的變化。在全細(xì)胞電壓鉗下也同樣未觀察到hAmylin引起電流變化。
　　利用免疫熒光技術(shù)，對神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)分別進(jìn)行特異性抗體染色。用hAmylin替代打孔劑Triton X-100后發(fā)現(xiàn)。神經(jīng)元經(jīng)短時間（1 min） hAmylin孵育后，鏡下即可觀察到免疫熒

25、光。而膠質(zhì)細(xì)胞短時間（1 min） hAmylin孵育后，并未觀察到免疫熒光。若孵育時間延長至30 min，則神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞于鏡下均可觀察到相應(yīng)免疫熒光。說明hAmylin在細(xì)胞表面聚合過程中，確實可以導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性的破壞，使一抗進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但不同種類的細(xì)胞膜，所需孵育時間不同。這可能是導(dǎo)致hAmylin在短時間內(nèi)，無法增加HEK293細(xì)胞[Ca2+]i的原因。
　　為進(jìn)一步確證hAmylin對細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響，我們利用掃描

26、電鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)經(jīng)hAmylin孵育后，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞膜完整性遭到破壞。對HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染LifeAct質(zhì)粒，標(biāo)記細(xì)胞骨架（F-actin）后，在活細(xì)胞工作站中，觀察hAmylin長時間作用。結(jié)果顯示，10μM hAmylin的長時間作用同樣可對HEK293細(xì)胞的細(xì)胞骨架造成損傷。
　　5.hAmylin對神經(jīng)元ROS生成及線粒體膜電位的影響
　　有報道指出，Aβ蛋白破壞細(xì)胞膜完整性的機(jī)制主要與其在細(xì)胞表面聚合

27、時生成ROS有關(guān)。我們猜想hAmylin破壞細(xì)胞膜完整性的機(jī)制可能與此相同。我們利用離子成像技術(shù)，對神經(jīng)元ROS的生成進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)高濃度（10μM）hAmylin可以明顯增加神經(jīng)元ROS的生成（P<0.001），而低濃度（1μM）hAmylin無此作用。說明ROS的生成主要與hAmylin的聚合有關(guān)。
　　我們利用JC-1染料，進(jìn)一步觀察hAmylin對神經(jīng)元線粒體膜電位的影響。發(fā)現(xiàn)高濃度（10μM）hAmylin可以明顯降低線

28、粒體膜電位，而低濃度（1μM）hAmylin無此作用。當(dāng)給予線粒體PTP開放抑制劑CsA（1μM）后，高濃度（10μM）hAmylin所導(dǎo)致的線粒體膜電位降低現(xiàn)象被顯著抑制（P<0.001），但不能抑制它所導(dǎo)致的[Ca2+]i增加及ROS的生成。說明hAmylin誘發(fā)的[Ca2+]i增加以及ROS生成還有其他機(jī)制。
　　結(jié)論：
　　hAmylin通過受體依賴及非受體依賴兩種機(jī)制誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元[Ca2+]i增加；低濃度hA