大腸桿菌DNA光修復(fù)酶（photolyase）的表達(dá)純化及其活性研究.pdf

1、DNA在紫外線誘導(dǎo)下會(huì)產(chǎn)生損傷，這種損傷會(huì)導(dǎo)致生物體生長(zhǎng)遲緩、誘發(fā)突變甚至死亡。DNA光修復(fù)酶(photolyase，EC4.1.99.3)可以吸收300-500nm的光子的能量來(lái)修復(fù)這種損傷。大腸桿菌photolyase含有兩個(gè)輔基，分別為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和次甲基四氫葉酸(MTHF)。FAD為活性催化所必需，其生理狀態(tài)是還原態(tài)(FADH-)的。MTHF則具有吸收傳遞能量的作用。 本文研究了DNA光修復(fù)酶(phot

2、olyase)的純化、發(fā)酵和活性檢測(cè)，并對(duì)其細(xì)胞和鼠體活性進(jìn)行了初步研究。 第一章photolyase的表達(dá)和純化E.coliphr基因構(gòu)建到表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)中，獲得pET-22b(+)：：phr(N+X)，該質(zhì)粒表達(dá)的目的蛋白為C末端偶聯(lián)有6×His-tag的融合蛋白。BL21(DE3)/pET-22b(+)∷phr(N+X)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，可表達(dá)近20％菌體總蛋白量的目的蛋白，其中約1/3為可溶性蛋白。利用

3、Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow一步親和層析進(jìn)行純化，可以獲得近95％電泳純的photolyase。UV-Vis掃描和熒光掃描結(jié)果表明E.coliphotolyase具有兩個(gè)輔基，為MTHF和FADH·。 第二章BL21(DE3)/pET22b(+)∷phr的補(bǔ)料發(fā)酵在10LBioFloIV發(fā)酵罐中利用補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)發(fā)酵表達(dá)含重組質(zhì)粒pET-22b(+)∷phr(N+X)的BL21(DE3)大腸