甲硫氨酸脫氫酶在大腸桿菌中高效表達(dá)、分離純化與酶活性分析.pdf

1、根據(jù)C.symbiosum gdh基因的序列設(shè)計(jì)引物mdhF，mdhR，并分別在引物的兩端引入BomHI和SalI的酶切位點(diǎn)。以插入metdh基因的M13mpl9 DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增的metdh基因亞克隆到高表達(dá)載體ptac85上，轉(zhuǎn)化E．coli Q100。亞克隆的metdh基因成功地在大腸桿菌中得到了表達(dá)。實(shí)驗(yàn)顯示：在37℃條件下，使用0.3 mM IPTG誘導(dǎo)10小時(shí)，可使MetDH蛋白含量在總蛋白中達(dá)到30

2、％。為了分離純化甲硫氨酸脫氫酶，首先利用45％-65％的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)分離；爾后經(jīng)QAE-Sephafose陰離子交換柱進(jìn)行離子交換層析，此時(shí)MetDH蛋白的純度可以達(dá)到79.8％；再利用Butyl-Sepharose柱進(jìn)行疏水層析，層析后MetDH蛋白的純度達(dá)到91.2％；最后使用Sepharose G-200凝膠層析柱進(jìn)行分子篩層析。經(jīng)過(guò)四種不同方法的分離與純化，最終將目的蛋白純化到在SDS-PAGE上只顯示一條帶，即達(dá)到電泳純。1

3、L大約可以純化得到30mg純蛋白。 在pH7.0條件下，用甲硫氨酸作底物時(shí)，MetDH在35℃表現(xiàn)最高的酶活力。雖然MetDH在65℃也能進(jìn)行催化作用，但酶活力明顯降低，僅只有35℃酶活力的54.4％；pH 對(duì)酶活的影響的研究表明，當(dāng)pH=8.0時(shí)，MetDH的催化活性最高。1mM Na<'+>，K<'+>，Mg<'2+>不影響MetDH的催化活性，但Fe<'3+>則完全抑制酶的催化作用。相同濃度的Cl<'->，SO<,4><'

4、2->也不影響MetDH的催化活性，但I(xiàn)<'->對(duì)酶活性稍有抑制作用，其相對(duì)活性只有對(duì)照的86.4％；0.1％Tween20不影響MetDH的催化活性，但0.1％SDS則完全抑制酶的催化作用。動(dòng)力學(xué)測(cè)定顯示：用甲硫氨酸作底物，在pH7.0、37℃條件下測(cè)得的MetDH的kcat/Km值為0.1183 M<'-1>S<'-1>。 根據(jù)高胱氨酸尿癥患者體內(nèi)的Met濃度高達(dá)20μM而正常人血液中的Met濃度為20～40μM，利用甲硫氨

5、酸脫氫酶顏色反應(yīng)，試圖嘗試建立一種區(qū)別正常人與患者體內(nèi)甲硫氨酸含量的方法。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在37℃和pH7.0條件下，將0.3mg/mLINT,0.03mg/mL PMS，1mmol/L NAD<'+>，20μM Met和0.05mg/mL MetDH混合后反應(yīng)5分鐘即可顯現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顏色變化，而在相同條件下與40μM Met反應(yīng)25分鐘也未顯現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顏色變化。本研究的結(jié)果為后續(xù)利用甲硫氨酸脫氫酶研制高胱氨酸尿癥診斷試劑盒提供了一個(gè)良