磁共振成像檢測報告基因FTH1在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞移植物中的可誘導(dǎo)表達(dá).pdf

1、背景與目的：
　　臨床上，磁共振成像（MRI）廣泛用于對疾病的診斷、分期、隨訪及預(yù)后；在分子影像學(xué)領(lǐng)域，MRI因為空間分辨率高，軟組織對比度好以及無輻射損傷等優(yōu)勢具有較大應(yīng)用潛力，尤其適用于對移植細(xì)胞示蹤的研究。MRI主要通過磁標(biāo)記成像和報告基因成像兩種方式實現(xiàn)對移植細(xì)胞的示蹤，前者采用MRI對比劑如金屬螯合物或者超順磁性氧化鐵顆粒（SPIO）直接標(biāo)記細(xì)胞。由于SPIO橫向弛豫率高，目前在細(xì)胞示蹤成像上應(yīng)用廣泛。但是，這種利用MR

2、I對比劑直接標(biāo)記細(xì)胞的方法，存在一個很大的缺陷，即對比劑會隨著細(xì)胞的分裂增殖逐漸降解，因而無法對移植細(xì)胞進(jìn)行長期示蹤。磁共振報告基因成像借助報告基因在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，能夠克服上述磁標(biāo)記成像存在的缺陷，很大程度上可實現(xiàn)對移植細(xì)胞的長期活體示蹤。
　　目前用于MR顯像的報告基因有多種，如β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、MagA和鐵蛋白等。在眾多的MRI報告基因中，鐵蛋白基因作為一種內(nèi)源性報告基因近年來備受關(guān)注。鐵蛋白為一種

3、儲鐵蛋白，有重鏈和輕鏈兩種亞基。其中，鐵蛋白重鏈多肽1（FTH1）具有亞鐵氧化酶的活性，可以促進(jìn)鐵的氧化和摻入，作為一種功能性磁共振報告基因已成為分子影像學(xué)研究的熱點。
　　然而，F(xiàn)TH1作為MRI報告基因的安全性是值得考慮的。目前，對FTH1表達(dá)對細(xì)胞有無影響的研究結(jié)果不完全一致。一些研究證明FTH1是一種抗凋亡基因，它可以增加細(xì)胞或組織對抗氧化應(yīng)激的能力。然而，也有報告指出，在某些特定的細(xì)胞如宮頸癌Hela細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞中，

4、FTH1的過表達(dá)會明顯降低細(xì)胞的增殖活性。此外，F(xiàn)TH1長期持續(xù)表達(dá)還會引發(fā)鐵代謝紊亂。雖然鐵是新陳代謝中多種生物活性酶的重要輔助因子，然而，過多的鐵會誘發(fā)大量活性氧自由基產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷或凋亡。
　　基于以上研究結(jié)果，為了盡量減少FTH1持續(xù)表達(dá)并聚鐵帶來的不利影響，有必要對 FTH1的表達(dá)水平和表達(dá)時間進(jìn)行精確調(diào)控，使其在需要MR成像時表達(dá)，不需要MR成像時關(guān)閉。四環(huán)素（Tet）誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)是一種常用的基因調(diào)控系統(tǒng)

5、，它利用四環(huán)素或其衍生物強力霉素（Dox）可在轉(zhuǎn)錄水平特異性地控制基因表達(dá)。
　　本實驗結(jié)合 MRI報告基因成像和四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的優(yōu)勢，通過構(gòu)建 Tet-on可誘導(dǎo) FTH1基因表達(dá)的慢病毒載體，將 FTH1基因穩(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)入人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SK-N-SH）中，探究MRI檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植物中 FTH1誘導(dǎo)表達(dá)的可行性，旨在為細(xì)胞移植示蹤提供一種可調(diào)控的、安全的MRI報告基因成像方法。
　　方法：
　　1

6、 Tet-on可誘導(dǎo)FTH1基因表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建及病毒包裝
　　應(yīng)用PCR擴(kuò)增FTH1基因，并將其插入Tet-on可誘導(dǎo)基因表達(dá)慢病毒載體（pLenti-Tet-on-MCS-3Flag-Puro）多克隆位點內(nèi)，通過 PCR及DNA測序鑒定重組慢病毒載體（pLenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro）是否構(gòu)建成功。接著在脂質(zhì)體2000介導(dǎo)下將 pLenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro和包裝質(zhì)粒p

7、Helper1.0、pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，收集慢病毒，采用 ELISA法測定病毒滴度。將獲得的慢病毒命名為Lenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro。
　　2強力霉素誘導(dǎo)FTH1在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)
　　慢病毒Lenti-Tet-on-FTH1-3Flag-Puro感染SK-N-SH細(xì)胞后，先加入嘌呤霉素（8μg/ml）篩選7 d，再加入嘌呤霉素（4μg/ml）篩選3 d即獲得可誘導(dǎo)

8、表達(dá) FTH1的 SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞。將未感染慢病毒的SK-N-SH細(xì)胞作為陰性對照。
　　通過免疫印跡和免疫熒光的方法半定量和動態(tài)評價 FTH1在SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞中的表達(dá)情況。采用3.0 T MR掃描檢測SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞在FTH1基因表達(dá)和基因沉默狀態(tài)下信號變化。應(yīng)用CCK-8試劑檢測SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞在高表達(dá)FTH1和添加FAC

9、培養(yǎng)后增殖活性的變化。最后，采用普魯士藍(lán)染色和透射電鏡檢測SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞高表達(dá)FTH1后的聚鐵情況。
　　3 MRI檢測SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞移植物中FTH1的誘導(dǎo)表達(dá)
　　健康雄性裸鼠（nude mice），6～8 w齡，20～25 g。將處于對數(shù)生長期的SK-N-SH和SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞分別種植在裸鼠左右后肢根部皮下，約14 d后腫瘤直徑為0.5～1

10、 cm。
　　隨機挑選一只荷瘤裸鼠，在其飲水中加入1 mg/ml Dox和5 mg/ml FAC，分別在0、3、5 d、、、、、、行3.0 T MR掃描，觀察到信號明顯變化后，撤除Dox和FAC，恢復(fù)裸鼠正常飲水7 d，再次MR掃描，檢測信號動態(tài)變化。
　　將荷瘤裸鼠隨機分為6組，分別在其飲水中加入不同濃度（0、0.5、1、2、4、6 mg/ml）Dox和5 mg/ml FAC，喂養(yǎng)5 d。3.0 T MR掃描并測定每組裸鼠

11、雙側(cè)腫瘤組織的橫向弛豫率 R2值，統(tǒng)計分析得出引起MRI信號明顯改變的Dox濃度，即最佳Dox濃度。
　　另外，再需要2組荷瘤裸鼠，1組不做任何處理（None：no Dox and no FAC）作為陰性對照；另1組僅向裸鼠飲水中加入最佳濃度的Dox，喂養(yǎng)5 d，行3.0 T MR掃描。
　　掃描結(jié)束后，將3組裸鼠（None：no Dox and no FAC；FAC：no Dox and5 mg/ml FAC；Dox/FA

12、C：2 mg/ml Dox and5 mg/ml FAC）雙側(cè)腫瘤組織取下，行普魯士藍(lán)染色、透射電鏡觀察組織聚鐵情況；行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察組織在高表達(dá)FTH1和聚鐵后有無明顯病理改變。
　　結(jié)果：
　　1 Tet-on可誘導(dǎo)FTH1基因表達(dá)的慢病毒載體鑒定、病毒包裝和滴度測定
　　利用基因重組技術(shù)、PCR及DNA測序證實已成功構(gòu)建Tet-on可誘導(dǎo)FTH1基因表達(dá)的重組慢病毒載體（pLenti-Tet-on-

13、FTH1-3Flag-Puro），繼而進(jìn)行慢病毒包裝，獲得病毒滴度約為1×109TU/ml，滿足實驗要求。2 SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞中FTH1基因的誘導(dǎo)表達(dá)及聚鐵能力
　　Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)TH1誘導(dǎo)表達(dá)量與Dox作用濃度及作用時間呈明顯依賴關(guān)系。0.6μg/ml Dox作用72 h后，F(xiàn)TH1的表達(dá)量達(dá)到峰值。同時，通過免疫熒光檢測標(biāo)簽蛋白flag的誘導(dǎo)表達(dá)情況，兩者結(jié)果一致。
　　3

14、.0 T MR掃描顯示，SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞高表達(dá)FTH1并添加500μM FAC培養(yǎng)72 h后，R2值明顯升高。細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果顯示，感染慢病毒及高表達(dá)FTH1對SK-N-SH細(xì)胞的增殖活性無明顯影響；但是，無論有無FTH1表達(dá)，相對高濃度(500μM)的FAC均會降低細(xì)胞增殖活性（P＜0.05），且高表達(dá)FTH1的SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞增殖能力降低更明顯（P＜0.05）。普魯士藍(lán)染色及透

15、射電鏡結(jié)果顯示，添加500μM FAC培養(yǎng)后，高表達(dá)FTH1的SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量鐵顆粒影；而無 FTH1表達(dá)的 SK-N-SH和SK-N-SH/Tet-on/FTH1僅在部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)鐵顆粒影。正常陰性對照組內(nèi)無明顯鐵顆粒影顯示。
　　3 MRI檢測SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞移植物中FTH1的誘導(dǎo)表達(dá)
　　為了檢測 SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞移植物中 FT

16、H1誘導(dǎo)表達(dá)的動態(tài)變化，我們在裸鼠飲水中加入1 mg/ml Dox和5 mg/ml FAC喂養(yǎng)不同時間后行MR掃描發(fā)現(xiàn)：未加入Dox和FAC，即FTH1基因表達(dá)沉默“OFF”時，雙側(cè)腫瘤組織信號無明顯差別；加入Dox和FAC喂養(yǎng)5 d，即開啟基因表達(dá)5 d“ON”，SK-N-SH/Tet-on/FTH1腫瘤組織信號較對側(cè)明顯降低；撤走Dox和FAC，即再次關(guān)閉FTH1表達(dá)“OFF”，恢復(fù)正常飲水7 d后，SK-N-SH/Tet-on/F

17、TH1腫瘤組織信號回到最初基礎(chǔ)水平，與對側(cè)比較無明顯差別。以上結(jié)果證明SK-N-SH/Tet-on/FTH1細(xì)胞移植物中FTH1基因的表達(dá)具有“開關(guān)”功能，利用MRI能夠檢測到FTH1表達(dá)的動態(tài)變化，且基因表達(dá)與Dox作用時間存在依賴關(guān)系。
　　為了探究體內(nèi)FTH1的表達(dá)是否與Dox濃度也存在一定依賴關(guān)系，我們在荷瘤裸鼠飲水中加入不同濃度Dox和5 mg/ml FAC喂養(yǎng)5 d后發(fā)現(xiàn)：Dox濃度為1 mg/ml時，SK-N-SH/

18、Tet-on/FTH1的R2值有一定程度升高；Dox濃度為2 mg/ml時， R2值是明顯升高的（P＜0.05）；繼續(xù)增加Dox濃度，R2值反而降低，至Dox濃度為6 mg/ml時，雙側(cè)腫瘤組織的信號無明顯差異。
　　MR掃描結(jié)束后，3組（None、FAC、Dox/FAC）裸鼠腫瘤組織的普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示：Dox/FAC組SK-N-SH/Tet-on/FTH1腫瘤組織內(nèi)可見明顯大量的藍(lán)染鐵顆粒；而同組對側(cè)SK-N-SH（未表達(dá)F

19、TH1）和 FAC組裸鼠雙側(cè)腫瘤組織（未表達(dá) FTH1）內(nèi)僅在少部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)藍(lán)染鐵顆粒；正常飲水的裸鼠雙側(cè)腫瘤組織內(nèi)均未見明顯藍(lán)染鐵顆粒。與此同時，透射電鏡結(jié)果顯示Dox/FAC組SK-N-SH/Tet-on/FTH1腫瘤組織內(nèi)可見較多的黑色致密鐵顆粒影，與普魯士藍(lán)染色結(jié)果一致。
　　最后，HE染色顯示SK-N-SH/Tet-on/FTH1腫瘤組織在高表達(dá)FTH1及聚集FAC后無明顯病理改變。
　　結(jié)論：
　　本實