PML蛋白在人星形細胞瘤中的表達及其促三氧化二砷誘導(dǎo)人星形細胞瘤細胞凋亡的機制.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤。由于腫瘤侵潤性生長，手術(shù)中難以實現(xiàn)全切除，即使結(jié)合化療、放療綜合治療，預(yù)后依然不佳。尋找膠質(zhì)瘤的預(yù)后指標(biāo)和提高化療、放療效果一直是膠質(zhì)瘤研究的重點。
　　 早幼粒細胞白血病(PML)蛋白參與調(diào)控細胞的生長、老化、凋亡等各種功能。在許多腫瘤中，PML蛋白都因某種機制在轉(zhuǎn)錄后被減少甚至完全消除，PML蛋白缺失和某些腫瘤的分級和進展相關(guān)。
　　 三氧化二砷(ATO)是中藥砒霜的主要成分，通過其誘導(dǎo)

2、凋亡的作用治療急性早幼粒細胞白血病獲得良好效果。美國已經(jīng)開始了應(yīng)用ATO治療膠質(zhì)瘤的臨床試驗，我國尚未見報道。
　　 本課題旨在探討PML蛋白在人腦星形細胞瘤中的表達及其對ATO誘導(dǎo)星形細胞瘤細胞凋亡的影響，并探討PML蛋白在ATO對星形細胞瘤細胞作用中的機制。
　　 第一部分 PML蛋白在人腦星形細胞瘤中的表達
　　 方法1.收集98例臨床星形細胞瘤和2例瘤旁正常腦組織石蠟標(biāo)本進行免疫組化染色，檢測PML蛋白表

3、達的情況。用SPSS10.0進行相關(guān)統(tǒng)計分析。2.采用Western blot檢測PML蛋白在人星形細胞瘤細胞系的表達。
　　 結(jié)果1.免疫組化顯示PML蛋白定位在細胞核，在正常腦組織中表達高，在星形細胞瘤組織中表達降低。I-IV級星形細胞瘤的PML蛋白表達呈逐漸下降趨勢，高級別星形細胞瘤的PML蛋白表達比低級別星形細胞瘤的表達低，但差異不明顯(P=0.057)。2.Western blot顯示PML蛋白在星形細胞瘤細胞系中均有

4、表達，蛋白定位在細胞核，PML蛋白在U87MG中表達高，在LN444中表達稍弱，在LN443中表達最弱。
　　 結(jié)論1.膠質(zhì)瘤組織中都有PML蛋白表達，表達量比正常腦組織減少，但無完全缺失。高級別星形細胞瘤比低級別星形細胞瘤PML蛋白表達減少。2.PML蛋白表達在人膠質(zhì)瘤細胞U87MG較高，LN444稍低，LN443最低，均定位在細胞核內(nèi)。
　　 第二部分三氧化二砷抑制體外人膠質(zhì)瘤細胞LN444的實驗研究
　　

5、方法1.用梯度濃度的ATO處理LN444膠質(zhì)瘤細胞，CCK-8比色法檢測細胞的增殖活性，計算ATO的細胞抑制率。2.倒置顯微鏡觀察ATO作用后細胞的形態(tài)變化。3.Hoechst染色觀察ATO誘導(dǎo)凋亡的作用。4.流式細胞儀PI染色檢測ATO作用后的細胞凋亡率。
　　 結(jié)果1.ATO對LN444膠質(zhì)瘤細胞增殖有明顯的抑制作用，在本實驗范圍內(nèi)，呈劑量依賴性和時間依賴性。2.ATO作用后細胞出現(xiàn)細胞質(zhì)濃縮、胞膜破裂、胞質(zhì)內(nèi)容物外溢等現(xiàn)象

6、。3.Hoechst染色顯示用藥后細胞出現(xiàn)細胞核體積縮小，不規(guī)則樣變，呈現(xiàn)致密濃染強熒光，隨著藥物濃度增加，出現(xiàn)核碎裂及凋亡小體等典型變化。4.PI染色顯示ATO處理后細胞凋亡顯著增加，呈劑量依賴性和時間依賴性。
　　 結(jié)論1.ATO對LN444膠質(zhì)瘤細胞有明顯的增殖抑制作用，抑制作用呈劑量依賴性和時間依賴性。2.ATO對LN444膠質(zhì)瘤細胞有誘導(dǎo)凋亡的作用
　　 第三部分下調(diào)PML蛋白表達對ATO誘導(dǎo)LN444細胞凋亡

7、的影響及機制的研究
　　 方法1.CCK-8比色法檢測ATO處理后U87MG、LN444和LN443的增殖活性，計算ATO對三種細胞的細胞抑制率。2.用熒光顯微鏡檢測PML特異的siRNA轉(zhuǎn)染LN444的效率，并用Western blot檢驗干擾PML蛋白表達的效果。3.CCK-8法檢測ATO處理后對照組(轉(zhuǎn)染無義siRNA)和轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染PML siRNA)的細胞活性，計算ATO對兩組細胞的細胞抑制率。4.用流式細胞儀Anne

8、xin V/PI雙染檢測ATO對照組和轉(zhuǎn)染組細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。5.用Western blot檢測ATO處理后對照組和轉(zhuǎn)染組細胞中的p53及acetyl-p53蛋白表達。
　　 結(jié)果1.ATO對U87MG的抑制作用最強，對LN444的抑制作用稍弱，對LN443的抑制作用最弱。2.siRNA的轉(zhuǎn)染效率>85％，轉(zhuǎn)染后PML蛋白表達顯著低于對照組，siRNA l的抑制效果最高。3.ATO對PML蛋白表達F調(diào)的LN444轉(zhuǎn)染細胞增殖抑

9、制作用減弱。4.ATO對PML蛋白表達下調(diào)的LN444轉(zhuǎn)染細胞誘導(dǎo)凋亡作用減弱。5.對照組和轉(zhuǎn)染組細胞均見p53和acetyl-p53表達。用藥后p53和acetyl-p53表達均隨時間下降。對照組p53下降快，acetyl-p53下降慢。轉(zhuǎn)染組p53下降慢，acetyl-p53下降快。
　　 結(jié)論1.ATO在LN444中能激活p53非依賴途徑誘導(dǎo)凋亡。2.ATO調(diào)節(jié)PML蛋白介導(dǎo)的p53降解，不影響PML蛋白介導(dǎo)的p53乙?；?/p>