不同時(shí)期離心力對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　觀察小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)成軟骨分化過(guò)程中，不同時(shí)期離心力對(duì)其的作用，探討力學(xué)因素與Notch信號(hào)通路在軟骨分化過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　昆明小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離，多次換液傳代培養(yǎng)至第3代，進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定，以1×106細(xì)胞量制作成細(xì)胞微團(tuán)。按處理因素的不同將試驗(yàn)分為5組：A組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第1周離心處理；B組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第2周離心處理；C組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第3周離心處理；D組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第4周離心處

2、理；E組：靜態(tài)培養(yǎng)，期間未進(jìn)行離心處理。實(shí)驗(yàn)采用Eppendorf5920 R恒溫離心機(jī)提供37℃，200G，2h/d相對(duì)離心力，每周換液2次。在相應(yīng)處理后于第7、14、21、28日采用CCK-8法和PCNA標(biāo)記法檢測(cè)離心處理后細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的增殖效率， RT-PCR分析 Sox9,Col-Ⅱ,及Notch信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)。Elisa法測(cè)定每次換液后各組培養(yǎng)基內(nèi)Col-Ⅱ的蛋白含量。28天后，番紅O染色檢測(cè)各組ECM，免疫熒光檢測(cè)

3、各組Col-Ⅱ表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.原代細(xì)胞呈類(lèi)圓形，24小時(shí)后可見(jiàn)少許貼壁，傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞集落形成，呈漩渦狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定為CD45陽(yáng)性表達(dá)，CD11b, CD34,CD29陰性表達(dá)。細(xì)胞純度高，為間充質(zhì)干細(xì)胞表型。
　　2.細(xì)胞增殖率檢測(cè)：A,B組較對(duì)照組細(xì)胞增殖明顯，C,D組細(xì)胞增殖效率與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。
　　3.RT-PCR檢測(cè)：誘導(dǎo)28天后Sox9與Col-Ⅱ表達(dá)相一

4、致，B,C組表達(dá)較對(duì)照組增高，A組較對(duì)照組降低，D組無(wú)明顯差異。Notch1和Hey1表達(dá)相一致，B,C組均較對(duì)照組降低；A,D組均升高。Hes1表達(dá)各組間沒(méi)有明顯差異。A組離心7天后（第1周末）與對(duì)照組相比，Sox9與Col-Ⅱ表達(dá)均降低（P<0.05），Notch1與Hey1表達(dá)均增高（P<0.05）；B組離心7天后（第2周末）與對(duì)照組相比，Sox9與Col-Ⅱ表達(dá)明顯增高（P<0.05），Notch1與Hey1表達(dá)降低（P<0.0

5、5）；C組離心7天后（第3周末）與對(duì)照組相比，Sox9與 Col-Ⅱ表達(dá)明顯增高（P<0.05），Notch1與Hey1表達(dá)降低（P<0.05）。
　　4.培養(yǎng)基中Col-Ⅱ的濃度隨著誘導(dǎo)時(shí)間呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，A組分泌Col-Ⅱ受到抑制，分化延遲，且終濃度較低；B組誘導(dǎo)效果最明顯，Col-Ⅱ早期分泌，且終濃度最高；C組誘導(dǎo)效果亦顯著，終濃度與B組相當(dāng)；D組誘導(dǎo)效果無(wú)差異。
　　5.番紅O及免疫熒光染色顯示各誘導(dǎo)組均