文昌魚鈣結(jié)合蛋白基因的鑒定、表達與進化研究.pdf

1、文昌魚(Amphioxus)是介于無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡類型，是研究動物進化和胚胎發(fā)育的典型材料。利用分子生物學(xué)手段，研究文昌魚有關(guān)基因的結(jié)構(gòu)、進化和表達，可以揭示文昌魚發(fā)育的分子生物學(xué)機制，有助于我們從分子水平上來了解脊椎動物的起源和進化。本文從青島文昌魚(Branchiostomabelcheritsingtauense)腸cDNA文庫(本實驗室保存)中，克隆了具有完整編碼框的鈣結(jié)合蛋白基因——鈣調(diào)素1基因(AmphiCaM

2、la和AmphiCaMlb)、AmphiCalbin基因和鈣相關(guān)蛋白基因(AmphiCaRP1和．AmphiCaRP2)，并對其結(jié)構(gòu)、進化和表達分別開展了研究。 本文從青島文昌魚的腸cDNA文庫中得到兩個編碼CaMl蛋白的CaMl基因，命名為AmphiCaMla和AmphiCaMlb。二者開放閱讀框內(nèi)僅有兩個核苷酸突變，其中一個造成一個氨基酸突變，這一點已經(jīng)通過半巢式PCR擴增在基因組水平上得到驗證。系統(tǒng)進化分析表明，三種文昌魚

3、的CaMl是傳統(tǒng)的鈣調(diào)素基因，CaM2也許是CaMl基因倍增的產(chǎn)物。Southern雜交結(jié)果進一步表明CaMl基因在青島文昌魚基因組中存在兩個拷貝。Northern雜交結(jié)果顯示，AmphiCaMla基因在文昌魚中存在兩個轉(zhuǎn)錄本。整體原位雜交、切片原位雜交和Northern雜交結(jié)果一致表明從晚期神經(jīng)胚一直到成體階段，AmphiCaMla基因在消化系統(tǒng)強烈表達并一直持續(xù)到成體。這提示在神經(jīng)胚期結(jié)束后，AmphiCaMla基因參與了文昌魚消化

4、系統(tǒng)的發(fā)育和行使功能，并且性成熟后在性腺也發(fā)揮一定的作用。作為現(xiàn)存的最接近于脊椎動物祖先的無脊椎動物，頭索動物文昌魚中兩個CaMl基因的存在及其表達模式的研究尚屬首次報道。 第三個從青島文昌魚腸cDNA文庫中克隆到的是編碼新型EF手形鈣結(jié)合蛋白(EFCaBPs)的AmphiCalbin基因。系統(tǒng)進化分析得到了兩個有趣的推論。首先，AmphiCalbin與一大組至今未命名的EFCaBPs聚類在一支，而與已鑒定的EFCaBPs分離開

5、來。其次，AmphiCalbin落在了脊椎動物未命名的EFCaBPs-支的基部，很可能代表了它們的原型。這一觀點從我們分析的基因組結(jié)構(gòu)上也得到了支持，AmphiCalbin與其脊椎動物的同源基因有著一致的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)組成。切片原位雜交和整體原位雜交結(jié)果一致顯示了AmphiCalbin基因在消化系統(tǒng)和性腺的組織特異性表達模式。這提示AmphiCalbin基因可能在消化系統(tǒng)和性腺發(fā)揮重要的作用，可以為我們進一步了解未命名．EFCaBP

6、s基因家族的表達模式奠定基礎(chǔ)。本文報道的最后兩個從青島文昌魚腸cDNA文庫中克隆到的基因是編碼鈣相關(guān)蛋白的AmphiCaRP1和AmphiCaRP2基因。序列與系統(tǒng)進化分析顯示，AmphiCaRP1和．AmphiCaRP2是鈣結(jié)合蛋白家族的新成員，無EF手形結(jié)構(gòu)，二者聚類在一起。RT-PCR分析表明，AmphiCaRP1和AmphiCaRP2基因在文昌魚成體的各個組織都表達，在肝盲囊表達豐度略高，提示AmphiCaRPl和AmphiCa