青鳉Pod1基因多克隆抗體的制備及表達(dá)分析.pdf

1、摘 要P o d l 基因在哺乳動物的性別分化、性腺發(fā)育、組織器官發(fā)生以及機(jī)體免疫等方面都有重要的作用，但是，在非哺乳脊椎動物發(fā)育過程中P o d l 基因可能具有的調(diào)控功能目前卻尚不清楚。而制備高效價、高純度、高特異性的抗體是研究基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能的首要前提。目前，尚未見有關(guān)P o d l 基因抗體制備及其在非哺乳脊椎動物組織中免疫定位的文獻(xiàn)報道。本研究以青壹；I 寄為實驗材料，獲得的主要結(jié)果如下：1 ．將己正確測序的青鯔P o

2、d l 基因翻譯成多肽序列，利用生物軟件從中篩選出最適合作為抗原的片段進(jìn)行合成，經(jīng)過H P L C 和質(zhì)譜的純化和檢測后，顯示合成的多肽分子量為1 7 7 4 ．0 0 D ，與理論值相符厶 口o2 ．將合成多肽與K L H 偶聯(lián)后作為抗原去免疫新西蘭大白兔，制備了P o d l 基因的多克隆抗體并進(jìn)行純化，S D S ．P A G E 檢測結(jié)果顯示多克隆抗體基本上只有輕鏈( 大小約2 5 如) 和重鏈( 大小約5 5 k D )兩個條

3、帶，純化效果良好；間接E L I S A 測得純化后的抗體效價為1 ：5 1 2 0 0 0 ；W e s t e r nB l o t 結(jié)果顯示多克隆抗體可特異性識別組織上相對分子質(zhì)量約為1 8 1 ( D 的蛋白質(zhì)，符合理論值。3 ．利用I m a g eJ 對W e s t e r n B l o t 中各組織蛋白及內(nèi)參G A P D H 的條帶進(jìn)行灰度分析，然后利用E x c e l 與S i g m a P l o t 把相應(yīng)

4、的結(jié)果用軟件轉(zhuǎn)換成直觀的柱形圖，結(jié)果表明P O D l 蛋白在肝臟中的表達(dá)含量最高，其次是卵巢，腸中的表達(dá)量最少。4 ．利用免疫組化和免疫熒光對P O D l 蛋白產(chǎn)物進(jìn)行組織定位研究，結(jié)果顯示P O D l 蛋白主要表達(dá)部位為：肝組織的中央靜脈附近、肝板A B S T R A C TP o d l g e n eh a s p l a y e d a n i m p o r t a n tr o l e i n s e x u a l

5、 d i f f e r e n t i a t i o n ，g o n a dd e v e l o p m e n t , o r g a n s f o r m a t i o n a n di m m u n i t y o fm a m m a l i a n ．H o w e v e r ’t h ef u n c t i o no f P o d lg e n ei nd e v e l o p m e n t w a

6、sk n o w n l i t t l ei nn o n - m a m m a l i a nv e r t e b r a t e s ．H i 曲t i t e r ，p u r i t ya n ds p e c i f i c i t ya n t i b o d yc a r lb eu s e d a sa ni m p o r t a n t t o o li ns t u d y i n gg e n e a n

7、dp r o t e i nf u n c t i o n ．N e v e r t h e l e s s t h e r e h a v e b e e n n o r e p o r t s r e g a r d i n g t h e P o d l g e n ep o l y c l o n a l a n t i b o d i e s p r e p a r a t i o n a n di m n l u n e l

8、 o c a l i z a t i o n i n n o n -m a m m a l i a nv e r t e b r a t e s ．W eu s e dm e d a k aa sam o d e la n i m a l ，t h em a i nr e s u k s a l e a sf o l l o w s ．1 ．P o d lg e n e s e q u e n c eo f m e d a k aw a

9、 s t r a n s l a t e di n t op e p t i d es e q u e n c e ，t h e na n a l y z e d a n d c h o o s e d c o r r e s p o n d p e p t i d e s e q u e n c e t ob es y n t h e s i z e db yb i o i n f o r m a t i c s s o f t w

10、a r e ．H P L C a n dM S r e s u l t s s h o wt h a t p e p t i d es e q u e n c e w a ss y n t h e s i z e dc o r r e c t l y ．2 ．T h e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e p r e p a r e d b y i m m u n i z i

11、n g N e wZ e a l a n d r a b b i t sw i t ht h e p u r i f i e dp e p f i d ec o u p l e d t oK L H ．t h et i t e r , p u r i t ya n d s p e c i f i c i t y o f t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e c o n

12、 f i r m e d b yS D S - P A G E ，E L I S A a n d W e s t e r n B l o t ．3 ．T h er e s u l t o fW e s t e r nB l o tb a n d s 鏟a ya n a l y s i s b yb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r es h o w st h a tP O D 1 p r o

13、t e i nw a se x p r e s s e dt h em o s ti n1 i v e ra n dt h el e a s ti n i n t e s t i n eo f a d u l tm e d a k a ．g ．P O D 1 p r o t e i n e x p r e s s i o nw a s d e t e r m i n e d b yi m m u n o h i s t o c h e

14、m i s t r ya n di m m u n o f l u o r e s c e n c e ，t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t P O D 1 p r o t e i n a r ee x p r e s s e di n h e p a t i cp l a t e ，h e p a t i cs i n u s o i da n da r o u n dc e n t

15、 r a lv e i ni nl i v e r ；m u c o s a l e p i t h e l i u m a n d i n t e s t i n a l w a l l i n i n t e s t i n e ；m y o c y t en u c l e u s i n m u s c l e ；m e m b r a n e a n dc y t o p l a s m e s p e c i a l l y