SD大鼠新基因PMP22CD的表達分析及其多克隆抗體制備.pdf

1、目的：SD大鼠PMP22CD是通過電子克隆的方法獲得的一新基因，NCBI基因登錄號AY-634367，已成功克隆了此基因，其功能尚未被研究，擬對其功能進行初步探索。 方法：首先通過生物信息學分析了解PMP22CD基因和編碼蛋白質的基本信息；構建原核表達重組質粒PET-32a(+)/PMP22CD，在大腸桿菌BL21(DE3 Lysis)中誘導表達融合蛋白，應用純化的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備PMP22CD多克隆抗體；其次應用

2、RT-PCR技術研究其在組織中的空間和時間表達譜，同時應用組織原位雜交和免疫組化方法分別在mRNA水平和蛋白水平研究PMP22CD在睪丸組織細胞中的表達情況：最后通過構建PEGFP-C1/PMP22CD野生型和突變型重組質粒，轉染HeLa細胞48h后，激光共聚焦觀察熒光分布，研究PMP22CD亞細胞定位和N-端信號錨定序列對PMP22CD蛋白定位的影響。 結果：PMP22CD具有四個外顯子，ORF為696bp，定位于染色體8q2

3、2，編碼的蛋白含有231個氨基酸殘基，具有四次跨膜螺旋，可能定位于內質網膜，C-端具有磷酸化位點，與家族中其他成員的親緣關系較遠。成功構建原核表達重組質粒PET-32a(+)/PMP22CD，在大腸桿菌BL21(DE3 Lysis)中獲得表達，融合蛋白主要以包涵體的形式存在，采用電洗脫的方法純化融合蛋白后免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，瓊脂糖雙向擴散試驗和Westem Blot顯示抗體具有一定的效價和特異性。表達譜顯示PMP22CD特異性得

4、表達于13月齡以后的睪丸組織。原位雜交與免疫組化結果顯示PMP22CD主要表達于14月齡大鼠睪丸組織各級精母細胞，在成熟的精子細胞未見其表達，顯示出生殖細胞表達時空特異性。野生型PEGFP-C1/PMP22CD表達的HeLa細胞，熒光主要聚集于細胞核周圍，呈顆粒狀分布，突變型PEGFP-C1/PMP22CD表達的HeLa細胞，熒光彌漫性的分布于整個細胞漿中，顆粒狀的分布形式消失。 結論：PMP22CD特異性的表達于13月齡以后的