萍鄉(xiāng)紅鯽Hira基因的克隆、表達(dá)分析及多克隆抗體制備.pdf

1、萍鄉(xiāng)紅鯽(Pingxiang red-transparent crucian carp,Carassius auratus var.Pingxiangnensis)是分布在江西省萍鄉(xiāng)地區(qū)的天然三倍體鯽突變體,經(jīng)人工選育后獲得的遺傳性狀基本穩(wěn)定的后代,具有兩性生殖和雌核發(fā)育兩種生殖方式。
　　 Hir/Hira基因是一種組蛋白基因表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)因子,其產(chǎn)物HIR/HIRA作為組蛋白的伴侶蛋白,廣泛存在于多種生物體內(nèi)發(fā)揮不同的作用。HI

2、RA蛋白家族最顯著的特點(diǎn)是氨基酸序列N端存在7個(gè)高度同源的WD40結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域常介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用,參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄或RNA加工、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中具有重要作用。另?yè)?jù)報(bào)道稱Hira基因可能對(duì)魚(yú)類(lèi)精核解凝發(fā)揮重要作用。因此,本研究以萍鄉(xiāng)紅鯽為材料,對(duì)Hira基因在三倍體魚(yú)類(lèi)中基因構(gòu)成及表達(dá)特征進(jìn)行了初步探索,為研究該基因在生殖發(fā)育過(guò)程中的作用打下基礎(chǔ)。主要內(nèi)容如下:
　　 1.

3、采用SMART cDNA合成和RACE-PCR等技術(shù),克隆得到全長(zhǎng)cDNA序列,長(zhǎng)度為3851bp,包含一個(gè)3033bp的開(kāi)放閱讀框,編碼1010個(gè)氨基酸。為提交和查閱序列方便,將此序列命名為 C.auratusvar.Pingxiangnensi-HIRA(簡(jiǎn)寫(xiě)為Cavp-HIRA),并提交到NCBI錄入GenBank中,登錄號(hào)為HM067834。另外,通過(guò)生物軟件分析,發(fā)現(xiàn)萍鄉(xiāng)紅鯽Hira基因與銀鯽Hira基因在進(jìn)化分類(lèi)上存在較高的

4、同源性,并且在其推導(dǎo)氨基酸序列N端包含7個(gè)WD40區(qū),因而推定萍鄉(xiāng)紅鯽HIRA屬于HIRA蛋白家族。
　　 2.利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Hira基因在萍鄉(xiāng)紅鯽心、肝、脾、腎、腦、肌肉、精巢、卵巢等組織中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在卵巢中大量表達(dá),而在其余組織中存在少量表達(dá)或是不表達(dá)的情況,與所做的RT-PCR結(jié)果基本吻合。
　　 3.在克隆得到的序列開(kāi)放閱讀框內(nèi),選取了一段長(zhǎng)550bp的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了蛋白原核表達(dá),