核呼吸因子基因的克隆表達(dá)及單克隆、多克隆抗體的制備.pdf

1、腫瘤能量代謝最顯著的特征是糖的有氧氧化能力顯著下降和糖的無氧酵解能力顯著增強(qiáng)，近年來研究發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象與腫瘤細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)與功能的異常有關(guān)，其分子生物學(xué)機(jī)制還不明確。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生能量的主要部位，由呼吸酶鏈氧化磷酸化完成其產(chǎn)能功能，呼吸酶各亞基由線粒體基因組和核基因組共同編碼，核呼吸因子（nuclearrespiratoryfactors,NRFs）在兩基因組間起協(xié)同轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，是保證線粒體功能完整性的重要轉(zhuǎn)錄因子，然而腫瘤能量代謝障礙

2、是否與NRFs對(duì)線粒體呼吸鏈亞基轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面的異常有關(guān)未見報(bào)道。本課題以人肝癌細(xì)胞系SMMC7721的cDNA為模板，克隆了NRFs和mtTFA(mitochondrialtranscriptionfactorA)基因編碼區(qū)。構(gòu)建了NRFs的原核表達(dá)載體，NRF-1的真核表達(dá)載體和NRF-1的RNA干涉載體，對(duì)NRF-1進(jìn)行了原核表達(dá)，制備了兔抗人NRF-1多克隆抗體和鼠抗人NRF-1單克隆抗體，為研究NRF-1及其靶基因的變化規(guī)律，觀

3、察其對(duì)腫瘤細(xì)胞能量代謝及增殖和凋亡的影響，揭示NRF-1對(duì)腫瘤線粒體呼吸功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提供了研究工具。
　　1．采用RT-PCR技術(shù)從人肝癌細(xì)胞系SMMC7721的cDNA中克隆NRF-1、NRF-2α、NRF-2β和mtTFA的基因，經(jīng)測序與GenBank公布的序列一致；構(gòu)建NRFs的原核表達(dá)載體，并對(duì)NRF-1進(jìn)行原核表達(dá)與分離純化，獲得NRF-1的純化蛋白，免疫動(dòng)物，制備兔抗人NRF-1多克隆抗體和鼠抗

4、人NRF-1單克隆抗體。我們采用His蛋白對(duì)抗體中針對(duì)His蛋白的成分進(jìn)行交叉吸收，中和抗體中針對(duì)His蛋白的成分后，ELISA結(jié)果表明，兔的多克隆抗體和鼠的單克隆抗體分別在1：8000和1：16000的情況下仍能夠與抗原NRF-1的蛋白結(jié)合；Westernblot結(jié)果顯示兔抗人NRF-1多克隆抗體和鼠抗人NRF-1單克隆抗體均能夠與NRF-1的融合蛋白特異性結(jié)合；免疫組化結(jié)果顯示：我們制備的兔抗人NRF-1多克隆抗體與商品化的多克隆抗

5、體一樣可以特異性地識(shí)別乳腺癌中的NRF-1抗原。
　　2．構(gòu)建NRF-1真核綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pEGFP-C3-NRF-1，將之轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，融合表達(dá)的EGFP-NRF-1的綠色熒光定位于細(xì)胞核。根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，利用軟件設(shè)計(jì)siRNA片段，裝入RNA干涉載體pSilencerTM3.1H1neo，用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法檢測其對(duì)NRF-1基因表達(dá)的抑制情況，RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h

6、后NRF-1的表達(dá)開始降低，72h后降低較為明顯，將RNA干涉載體命名為pSilencer-siNRF-1。
　　本研究成功地克隆了NRFs和mtTFA的基因，并對(duì)NRF-1進(jìn)行了原核表達(dá)，在國內(nèi)首次制備了NRF-1兔的多克隆抗體和鼠的單克隆抗體。構(gòu)建了NRFs的原核表達(dá)載體，NRF-1的真核表達(dá)載體和NRF-1的RNA干涉載體，為研究NRF-1及其相關(guān)基因的變化規(guī)律，觀察其對(duì)腫瘤線粒體呼吸功能和能量代謝的影響，揭示NRF-1的轉(zhuǎn)