新型抗人腸道病毒71型單克隆抗體中和保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及機(jī)制.pdf

1、人腸道病毒71型(enterovirus71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是手足口病最常見(jiàn)的病原體。自1969年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，EV71已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)，尤其是亞太地區(qū)引起了數(shù)十次手足口病的大流行，造成了數(shù)千萬(wàn)人感染，數(shù)萬(wàn)患者產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥。我國(guó)是手足口病疫情的高發(fā)區(qū)，2009年以來(lái)，該疾病的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)連續(xù)7年位居丙類傳染病之首。盡管現(xiàn)在EV71的疫苗完成三期臨床試驗(yàn)準(zhǔn)備上市，但是對(duì)于重癥患者，目前尚無(wú)有效的治療策略，因此研制

2、抗病毒的特效藥物迫在眉睫。
　　EV71病毒顆粒是一個(gè)直徑約300埃的正二十面體結(jié)構(gòu)，成熟病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中VP2、VP3和VP1的大部分區(qū)域位于病毒衣殼外部，VP4和VP1的N端位于衣殼的內(nèi)部。研究表明，在脫衣殼的過(guò)程中，病毒構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，5次軸處附近的“峽谷”發(fā)生坍塌形成小孔，疏水口袋內(nèi)的鞘氨醇分子釋放;2次軸處的VP2的反向平行α螺旋對(duì)會(huì)像兩側(cè)平移，形成直徑超過(guò)9埃的“孔洞”，埋藏在2次軸正

3、下方的VPl N端會(huì)遷移到病毒外部，參與核酸釋放通道的形成。因此篩選針對(duì)不同結(jié)合表位的單克隆抗體有助于進(jìn)一步闡述病毒脫衣殼的生物學(xué)機(jī)制。
　　本課題采用滅活病毒和重組衣殼蛋白分別免疫Balb/C小鼠，運(yùn)用經(jīng)典的雜交瘤篩選技術(shù)，獲得了15株可以特異性結(jié)合EV71病毒的單克隆抗體，其中包括6株中和保護(hù)抗體。動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明，在10ug/g乳鼠體重抗體的使用劑量下，6G5、12B6、2B6、2G12的保護(hù)效率均能達(dá)到100％，在2ug/

4、g的抗體劑量下，6G5的保護(hù)率仍能維持100％，12B6也能達(dá)到80％的保護(hù)，高于目前文獻(xiàn)所報(bào)道的中和保護(hù)性單抗。針對(duì)目前EV71可以引起無(wú)菌性腦膜炎(asepic meningitis)、腦炎(encephalitis)、腦脊髓炎(encephalomyelitis)和急性弛緩性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，我們同時(shí)也在神經(jīng)細(xì)胞上測(cè)試了15株單克隆抗體的中和保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)與人橫紋

5、肌瘤細(xì)胞相比，在相同滴度病毒的攻擊下，2B6的保護(hù)效果有了大幅度的提高。究其原因，推測(cè)是因?yàn)镋V71在肌肉組織和神經(jīng)系統(tǒng)不同的入侵機(jī)制所導(dǎo)致。
　　根據(jù)體內(nèi)外保護(hù)功能和識(shí)別表位的異同可以將中和保護(hù)抗體分為3類進(jìn)行研究，第一類2B6、2G12可以結(jié)合VP1-GHloop上的215-KQEKD-219，第二類7G6、12H3識(shí)別VP1 N端的4-VADVI-8，第三類6G5、12B6為空間表位，為鑒定6G5所識(shí)別表位，我們運(yùn)用冷凍電鏡

6、技術(shù)，解析6G5Fab與三種不同病毒生理周期的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，包括6G5Fab-天然成熟病毒，6G5Fab-空心病毒和6G5Fab-皺縮的空心病毒，分辨率分別達(dá)到了5.6埃、4.9埃和5.0埃。6G5識(shí)別位點(diǎn)位于病毒顆粒的2次軸和3次軸之間，分布在VP2和VP3的交匯處，包括VP2上135-139位的LDTKL，223-226位的GADG，296-298位的GAT和VP3上73-81位的VSAQAGKGE，144-147位的KDRA，209

7、-212位的PNTA。這些構(gòu)成了一個(gè)由“凹槽”“把手”和“峽谷”組成的復(fù)雜的結(jié)合區(qū)域。通過(guò)突變6G5可變區(qū)上與病毒表位相互作用的關(guān)鍵氨基酸，發(fā)現(xiàn)組成該空間表位的6個(gè)功能域均參與了6G5與病毒的結(jié)合。
　　隨后我們深入研究了三類抗體的中和保護(hù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)2B6的結(jié)合通過(guò)降低VP1-GHloop的柔性來(lái)穩(wěn)定5次軸附近“峽谷”底部的結(jié)構(gòu)，從而抑制病毒的構(gòu)象變化，影響病毒的脫顆粒進(jìn)程;7G6可以阻礙病毒核酸通道的形成，抑制病毒核酸的釋放;最