食源性單核增生性李斯特氏菌的分布、遺傳多態(tài)性及其毒理機(jī)制研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌(Listeria moncytogenes，Lm)是一種重要的食源性病原菌，由于其具有分布廣、耐受力強(qiáng)、高致病力等特點(diǎn)而備受食品安全領(lǐng)域關(guān)注。為了探明保定、石家莊及周邊地區(qū)食源性單增李斯特菌的污染狀況;探明該地區(qū)食源性單增李斯特菌的遺傳多態(tài)性;了解食源性單增李斯特菌的毒力基因分布狀況、毒力基因在其生長(zhǎng)周期中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)規(guī)律、在不同宿主條件下毒力基因表達(dá)水平以及食源性單增李斯特菌的致病力等情況。本研究對(duì)從保定

2、、石家莊及周邊地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市采集七大類(lèi)食品共1288個(gè)樣品進(jìn)行單增李斯特菌的污染調(diào)查;對(duì)鑒定分離出的308株食源性單增李斯特菌的27個(gè)毒力基因的分布情況進(jìn)行了PCR檢測(cè);采用RAPD法對(duì)308株食源性單增李斯特菌的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，并采用不加權(quán)成對(duì)算數(shù)平均法(UPAMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)對(duì)其主要毒力基因的表達(dá)量進(jìn)行了時(shí)序性表達(dá)研究;采用天然肉湯培養(yǎng)及熒光定量PCR分析法對(duì)單增李斯特菌在不同

3、宿主條件下主要毒力基因表達(dá)水平進(jìn)行研究;采用小鼠毒力實(shí)驗(yàn)對(duì)一些毒力基因缺失株單增李斯特菌進(jìn)行致病力實(shí)驗(yàn)。通過(guò)本研究得到如下結(jié)論:
　　(1)通過(guò)對(duì)保定、石家莊地區(qū)七大類(lèi)食品中單增李斯特菌的污染調(diào)查表明:單增李斯特菌在該地區(qū)食品中的平均檢出率為23.91％，其中生肉高達(dá)40.60％，熟肉制品和水產(chǎn)品分別達(dá)到25.42％和23.46％，而其他食品中較少;動(dòng)物源食品檢出率高于植物源食品。
　　(2)優(yōu)化并建立了單增李斯特菌的RAP

4、D分型方法，得出了308株食源性單增李斯特菌的DNA指紋圖譜，根據(jù)菌株之間的親緣關(guān)系制作食源性單增李斯特菌的遺傳進(jìn)化樹(shù);
　　(3)通過(guò)對(duì)308株食源性單增李斯特菌的RAPD遺傳多態(tài)性分析，可將308株單增李斯特菌分成6個(gè)基因類(lèi)群，其中第Ⅱ聚類(lèi)和第Ⅰ聚類(lèi)為保定、石家莊地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群;食源性單增李斯特菌具有一定的寄主偏好性，其傳播流行具有明顯的時(shí)間性和地域性;
　　(4)通過(guò)對(duì)七大類(lèi)食品中308株單增李斯特菌分離株中的27個(gè)毒

5、力基因的PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與侵入、感染有關(guān)的毒力基因在動(dòng)物源食品分離株中分布明顯高于植物源食品分離株中;與黏附、調(diào)控有關(guān)的毒力基因在兩者中差別不明顯;該地區(qū)屬于Ⅰ型的單增李斯特菌其毒力基因的平均含量要高于Ⅱ型的菌株;該地區(qū)食源性單增李斯特菌分離株中hfq、dltC和iap檢出率最高，可作為該地區(qū)食源性單增李斯特菌鑒定的參考基因;
　　(5)單增李斯特菌的毒力基因表達(dá)量在菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期后期(16h～18 h)達(dá)到高峰，以后表達(dá)量逐漸

6、降低，但直到菌體生長(zhǎng)衰亡期仍保持較高表達(dá)量;在豬、雞、牛、羊四種肉湯培養(yǎng)基中毒力基因表達(dá)水平差異明顯，表明單增李斯特菌在不同宿主條件下其毒力基因表達(dá)量不同;
　　(6)毒理試驗(yàn)結(jié)果表明:hlyA基因?qū)卧隼钏固鼐闹虏×哂袥Q定性作用，inlA、prfA和virR基因?qū)卧隼钏固鼐闹虏×τ绊戄^大，而plcA，actA、plcB、dltA、dltD等基因?qū)卧隼钏固鼐虏×杏绊懙鄬?duì)較小。
　　本論文研究成果將為食源性單