ATRX-C抗體的制備及在HPV16陽(yáng)性宮頸癌組織中的初步應(yīng)用.pdf

1、[目的]研制和初步評(píng)價(jià)ATRX-C抗體；分析ATRX蛋白在THP-1細(xì)胞中的定位及ATRX在人乳頭瘤病毒16型（HPV16）陽(yáng)性宮頸癌組織中的表達(dá)和定位，為深入探討ATRX蛋白在HPV16所致宮頸癌中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　[方法]設(shè)計(jì) ATRX C端基因片段(2193-2492氨基酸)引物，利用PCR擴(kuò)增目的片段，雙酶切后連接表達(dá)載體 pET30a，經(jīng) PCR、酶切、測(cè)序分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a/ATRX-C219

2、3-2492；將質(zhì)粒 pET30a/ATRX-C2193-2492轉(zhuǎn)化 E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳離子親和層析法純化6His-ATRX-C2193-2492蛋白，利用Western blot檢測(cè)純化產(chǎn)物6His-ATRX-C2193-2492；將純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白以皮下多點(diǎn)注射和腹腔注射方式免疫接種6只8周齡雌性BALB/c小鼠。初次免疫3周后，再免疫1次；第4、5周后分別再加強(qiáng)1

3、次，共免疫接種4次。每次免疫前及末次免疫后7天取血，ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。飽和硫酸銨鹽析沉淀法初步純化抗血清，并用Western blot檢測(cè)之；利用間接免疫熒光檢測(cè)Daxx和ATRX在THP-1細(xì)胞株中的分布與定位；收集正常宮頸組織細(xì)胞、HPV16陽(yáng)性的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）、原位癌和浸潤(rùn)型宮頸癌組織標(biāo)本，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)宮頸組織中ATRX的分布和定位以及表達(dá)量；利用Western blot檢測(cè)正常宮頸組織，HPV16陽(yáng)性的宮

4、頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）、原位癌和浸潤(rùn)型宮頸癌組織細(xì)胞中ATRX的表達(dá)量。
　　[結(jié)果]經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建 pET30a/ATRX-C2193-2492原核表達(dá)載體；表達(dá)載體pET30a/ATRX-C2193-2492在 E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)分子量約34kDa產(chǎn)物，且該產(chǎn)物能與ATRX抗體發(fā)生反應(yīng)，并且純化得到目的產(chǎn)物；利用純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫小鼠，制備的抗ATRX-C2193

5、-2492多克隆抗體，其效價(jià)為1:12800；在THP-1細(xì)胞中，ATRX顯綠色信號(hào)和Daxx顯紅色信號(hào)，兩種信號(hào)都定位于細(xì)胞核，融合時(shí)出現(xiàn)黃色信號(hào)；ATRX在正常宮頸組織細(xì)胞具有較高表達(dá)并主要定位在細(xì)胞核；在 HPV16陽(yáng)性的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織細(xì)胞的表達(dá)與正常細(xì)胞類(lèi)似；在原位癌組織細(xì)胞中表達(dá)量姣 CIN中減低，主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞漿；在浸潤(rùn)型宮頸癌組織細(xì)胞中表達(dá)量降低，主要定位在細(xì)胞漿，細(xì)胞核中表達(dá)量明顯減少。