HPV16整合至宿主基因組導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理研究.pdf

1、研究背景與目的:作為最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,宮頸癌每年在全球約有50萬(wàn)新發(fā)病例和23萬(wàn)死亡病例,嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生存。因此,宮頸癌的防治工作刻不容緩。2008年的諾貝爾獎(jiǎng)向人們昭示著人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV),尤其是高危型 HPV感染是發(fā)生宮頸癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因素,病毒的E6與E7兩種癌蛋白可干擾細(xì)胞周期、凋亡和染色體的穩(wěn)定性最終導(dǎo)致細(xì)胞的永生化,從而逐步發(fā)展為宮頸癌。然而,盡管95％以上的

2、宮頸癌中均發(fā)現(xiàn)了HPV病毒的癌蛋白表達(dá),但卻不是每一個(gè)感染高危型 HPV的患者均發(fā)生了宮頸癌。因此,深入探索 HPV的致病機(jī)制極其與宮頸癌的內(nèi)在關(guān)聯(lián),從而得到精確反映宮頸癌發(fā)生和預(yù)后的標(biāo)記物并靶向性對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行分子阻遏,已成為眾多婦科腫瘤學(xué)者們研究的重要方向。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的進(jìn)展,人們逐漸發(fā)現(xiàn) HPV與宿主染色體的整合才是宮頸細(xì)胞永生化過(guò)程中的重要步驟,HPV整合位點(diǎn)附近宿主基因組的表達(dá)變化及整合后病毒癌基因的表達(dá)

3、增強(qiáng)可能是宮頸癌發(fā)病過(guò)程中的重要導(dǎo)火索。然而,HPV的整合位點(diǎn)在宿主基因組上的分布規(guī)律至今存在爭(zhēng)議,且缺乏中國(guó)人整合位點(diǎn)的研究資料。本項(xiàng)目擬從大量臨床樣本中尋求 HPV16的整合規(guī)律,鎖定特定高發(fā)位點(diǎn)并同時(shí)具有臨床和分子生物學(xué)特征的人群,探索 HPV16整合至該位點(diǎn)后發(fā)揮關(guān)鍵作用的靶基因,并通過(guò)構(gòu)建模擬人體自然感染狀態(tài)的細(xì)胞模型來(lái)在多基因水平對(duì) HPV16整合至特定位點(diǎn)后的宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程進(jìn)行驗(yàn)證,明確 HPV16整合至特定位點(diǎn)后其

4、靶基因的變化在宮頸癌發(fā)病中的作用。從而為宮頸癌的分子分型平臺(tái)提供新的理論基礎(chǔ),以期從 HPV16整合至特定位點(diǎn)這一特殊現(xiàn)象窺視宮頸癌整個(gè)群體的發(fā)病機(jī)理學(xué)研究,為推動(dòng)宮頸癌的靶向基因阻遏技術(shù)的進(jìn)展并早日實(shí)現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化提供實(shí)用探索。
　　方法:
　　1.HPV16感染標(biāo)本及感染狀態(tài)的篩查:選取因子宮頸癌行廣泛性全子宮切除術(shù)后獲得的宮頸癌冰凍組織,按照 DNA提取試劑盒的要求逐步提取標(biāo)本 DNA,PCR法反復(fù)篩查及驗(yàn)證 HPV16

5、感染,對(duì)明確感染類(lèi)型的標(biāo)本行多次 PCR擴(kuò)增法確定宮頸癌組織中HPV16感染狀態(tài)。
　　2.宮頸癌組織中HPV整合位點(diǎn)的分布及其臨床意義:選取已明確 HPV感染類(lèi)型為16型的宮頸癌冰凍組織,采用Trizol消化法提取冰凍組織 RNA并逆轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的CDNA,用巢式 PCR法檢測(cè)宮頸癌組織中HPV整合位點(diǎn),并分析其宿主相鄰基因及基因座特點(diǎn);調(diào)取所有樣本的臨床資料,將患者的臨床特征按照整合位點(diǎn)的分類(lèi)進(jìn)行對(duì)比分析,剖析 HPV整合位點(diǎn)與宿

6、主臨床表現(xiàn)之間的內(nèi)在聯(lián)系。
　　3.HPV整合至線粒體導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶基因篩選:用Real-time PCR的方法檢測(cè)不同整合位點(diǎn)的宮頸癌樣本的線粒體基因表達(dá),并分為整合至線粒體、整合至宿主染色體、正常宮頸組織等三組進(jìn)行對(duì)比;調(diào)取整合至宿主線粒體的樣本的臨床資料,分析該群患者的臨床特征;隨機(jī)選取整合至宿主染色體標(biāo)本3例、整合至宿主線粒體標(biāo)本4例與正常宮頸組織4例送基因芯片檢測(cè);根據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果篩選出HPV整合至宿主線粒體

7、后的關(guān)鍵靶基因并在不同級(jí)別宮頸病變的臨床樣本石蠟切片行免疫組化驗(yàn)證,利于相應(yīng)組織 RNA進(jìn)行靶基因表達(dá)的Real-time PCR驗(yàn)證;通過(guò)構(gòu)建不同的細(xì)胞模型來(lái)模擬 HPV整合至宿主線粒體的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,明確 HPV整合至線粒體導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。
　　4.宮頸角化細(xì)胞原代培養(yǎng)模型的建立:選取在同濟(jì)醫(yī)院因非惡性腫瘤性疾病并排除宮頸癌前病變和HPV感染而行全子宮切除的新鮮正常宮頸上皮樣本,分別用直接培養(yǎng)法和3T3細(xì)胞共飼法培養(yǎng)

8、宮頸角化上皮;激光共聚焦顯微鏡鑒定細(xì)胞分類(lèi),排除成纖維細(xì)胞的污染;細(xì)胞周期阻滯后滴片行染色體核型分析驗(yàn)證細(xì)胞是否與正常二倍體細(xì)胞染色體形態(tài)一致。
　　結(jié)果:
　　1.HPV16在192例宮頸癌組織標(biāo)本中的感染率為56.57％;在112例感染 HPV16的宮頸癌標(biāo)本中,HPV16單純整合感染的病例共有73例,陽(yáng)性率達(dá)到65.18％(73/112),HPV16游離型樣本有17例(占所有 HPV16感染樣本的15.18％),HPV

9、16游離型與整合型混合感染的樣本有22例(占所有 HPV16感染樣本的19.64％)。
　　2.112例 HPV16感染的樣本中共有86例樣本查出了整合轉(zhuǎn)錄體,得到整合位點(diǎn)98個(gè),其中12例位于線粒體上,8例位于線粒體基因 ND3位點(diǎn),4例位于線粒體 RNR2位點(diǎn);86例位于宿主染色體上,除8號(hào)、9號(hào)、18號(hào)、22號(hào)等染色體外廣泛分布在宿主各條染色體上,其中常見(jiàn)脆性位點(diǎn)26例,罕見(jiàn)脆性位點(diǎn)8例,非脆性位點(diǎn)52例。追蹤以上患者的臨床

10、特征提示除淋巴轉(zhuǎn)移率外,整合至宿主染色體各位點(diǎn)與整合至線粒體的患者在其他臨床特征方面均無(wú)顯著性差異。
　　3.整合至線粒體的標(biāo)本中其9種線粒體基因表達(dá)較正常組織均有明顯降低,僅整合至宿主核 DNA的標(biāo)本其9種線粒體基因的表達(dá)較正常組織多有明顯升高或有輕度降低;整合至線粒體的12例患者中有7例腫瘤為低分化且均為Ⅱa期及以上患者,4例為宮頸中分化鱗癌且其中1例雖為Ⅰb期但術(shù)后2年內(nèi)即復(fù)發(fā);芯片檢測(cè)聚類(lèi)結(jié)果提示:三組間差異明顯,包括線粒

11、體基因在內(nèi)的數(shù)百個(gè)基因組間差異明顯;芯片分析提示腫瘤組織與正常組織間代謝相關(guān)基因差異明顯,HPV整合至線粒體較整合至染色體的宮頸癌組織間代謝相關(guān)基因亦有明顯差異,但差異相對(duì)較小,提示 HPV整合至線粒體可能導(dǎo)致了宮頸癌的進(jìn)一步代謝變化。
　　4.兩種培養(yǎng)方法均獲得原代培養(yǎng)的宮頸角化上皮;培養(yǎng)之上皮細(xì)胞角蛋白抗體免疫熒光檢測(cè)陽(yáng)性、vimitin抗體免疫熒光染色陰性,提示上皮細(xì)胞成分純正,無(wú)成纖維細(xì)胞污染;染色體核型分析示每個(gè)細(xì)胞含有

12、46條染色體,形態(tài)與人正常二倍體細(xì)胞染色體一致。
　　結(jié)論:
　　1.HPV16在宮頸癌組織中是最常見(jiàn)的HPV感染類(lèi)型,其存在形式多以整合型存在,但仍有少部分樣本以混合或游離型存在。
　　2.HPV16在宿主染色體的整合呈廣泛分布,其脆性位點(diǎn)的整合幾率為39.53％,以常見(jiàn)脆性位點(diǎn)為主;HPV16在宿主線粒體的整合具有相對(duì)高發(fā)性,且位點(diǎn)集中明顯;HPV16在宿主染色體的整合位點(diǎn)分布與其臨床特征并無(wú)特定關(guān)系,但整合至線粒