腫瘤干細(xì)胞在喉癌Hep-2細(xì)胞化療抵抗中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分免疫磁珠分選與化療藥物富集喉癌Hep-2細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比較
　　 目的：比較免疫磁珠分選(MACS)及化療藥物順鉑(DDP)篩選富集喉癌Hep-2細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞的效果。
　　 方法：以CD133免疫磁珠分選、DDP作用兩種方法來(lái)富集喉癌Hep-2細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞，并以流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)處理后CD133+細(xì)胞百分率，同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，判斷兩種方法分選后細(xì)胞對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果：經(jīng)FCM檢測(cè)

2、，MACS分選喉癌Hep-2，CD133+細(xì)胞得率為64.33％，不同濃度DDP作用于喉癌Hep-2細(xì)胞48 h，F(xiàn)CM檢測(cè)CD133+細(xì)胞有不同的得率，其中濃度為4μg/ml時(shí)，所得CD133+細(xì)胞百分率最高，為50.7％。MACS與DDP各組比較差異均有顯著性(P<0.01)；兩種方法處理后細(xì)胞的存活狀態(tài)MACS組要好于DDP組。
　　 結(jié)論：MACS分選純度較高，對(duì)細(xì)胞損傷小，適合后續(xù)培養(yǎng)；但分選前耗時(shí)長(zhǎng)，每次分選僅能用于

3、一種marker。DDP篩選簡(jiǎn)單易行，符合臨床TSC抵抗化療的模式。但陽(yáng)性細(xì)胞得率與細(xì)胞毒性成正比。MACS和DDP篩選腫瘤干細(xì)胞各有其優(yōu)勢(shì)及適用范圍，實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)不同目的來(lái)確定所用篩選方法。
　　 第二部分喉癌Hep-2細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞化療抵抗及其機(jī)制
　　 目的：探討喉癌Hep-2細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物DDP的抵抗作用。
　　 方法：培養(yǎng)細(xì)胞分別接種于96孔板和6孔板，經(jīng)濃度分別為1μg/ml、2μg/m

4、l、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml的DDP作用于喉癌Hep-2細(xì)胞，作用時(shí)間為24h、48h、72h，收集96孔板內(nèi)細(xì)胞，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，收集6孔板細(xì)胞行FCM檢測(cè)細(xì)胞中CD133+細(xì)胞百分率。
　　 結(jié)果：在所研究劑量及時(shí)間范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率與DDP劑量及作用時(shí)間不呈線性關(guān)系；CD133+細(xì)胞比例在2μg/ml、24h檢測(cè)CD133+比例小于空白組，其余各濃度及各時(shí)間點(diǎn)CD133+比例就有不同程度地富集；4

5、8h CD133+細(xì)胞富集率最顯著，濃度為2μg/ml在各時(shí)間點(diǎn)上的檢測(cè)值均低于其它濃度，濃度為4μg/ml的DDP在各時(shí)間點(diǎn)富集率都高于其它濃度。
　　 結(jié)論：DDP作用后，CD133+細(xì)胞比例上升，喉癌Hep-2細(xì)胞中CD133+細(xì)胞可以抵抗化療藥物DDP的作用。特定濃度下可以誘導(dǎo)Hep-2-CD133+細(xì)胞分化。
　　 第三部分Oct-4維持喉癌Hep-2中腫瘤干細(xì)胞干性并調(diào)節(jié)其分化
　　 目的：檢測(cè)Oct

6、-4在喉癌Hep-2細(xì)胞中及經(jīng)DDP作用后的表達(dá)情況。
　　 方法：培養(yǎng)的人喉癌Hep-2細(xì)胞，經(jīng)濃度分別為1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml的DDP作用48h后，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中Oct-4的表達(dá)情況，并與CD133表達(dá)情況相比較。
　　 結(jié)果：ICC結(jié)果：喉癌Hep-2細(xì)胞中Oct-4微量表達(dá)，經(jīng)DDP作用后，細(xì)胞中Oct-4表達(dá)位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，表達(dá)情況與CD133表達(dá)情況