乳酸誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:調(diào)查研究表明肺癌是全球發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，目前來說相對(duì)的5年生存率僅為18％，造成肺癌患者遠(yuǎn)期生存率較低的主要原因是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，研究數(shù)據(jù)表明，約80-90%的肺癌患者的死亡是由腫瘤的轉(zhuǎn)移引起的，因此，探討肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制并采取相應(yīng)的預(yù)防、治療措施具有重大的臨床意義和社會(huì)意義。肺癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)、漸進(jìn)的涉及多基因并且有諸多步驟的動(dòng)態(tài)過程，可能涉及到多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路的改變和關(guān)鍵基因結(jié)構(gòu)、功能的異常。近

2、年研究表明在腫瘤有氧糖酵解過程中，乳酸的不斷積累與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作為腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)早期事件可能會(huì)受到乳酸積累的影響，所以本研究就乳酸對(duì)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響進(jìn)行探討，進(jìn)而研究乳酸對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。有研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程受幾種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子Snail是已知可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白的一個(gè)關(guān)鍵因子，因此本研究進(jìn)一步探討了乳酸是否通過影響轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。本文旨在

3、深入研究乳酸和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的聯(lián)系及其分子機(jī)制，有利于進(jìn)一步闡明腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，從而為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　材料與方法:選取人非小細(xì)胞腺癌細(xì)胞株H1299作為研究對(duì)象。?采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)研究乳酸對(duì)H1299細(xì)胞株遷徙能力的影響，統(tǒng)計(jì)穿過ECM膜的細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制柱狀圖。?用不同濃度的乳酸（5、10、15、20、30mM）刺激H1299細(xì)胞，通過Western blotting方法檢測(cè)EMT分

4、子標(biāo)志蛋白的變化，應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值，統(tǒng)計(jì)分析后繪制蛋白灰度比值的柱形圖。?在H1299細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染LDHA siRNA,隨后用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及EMT標(biāo)志物的變化，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值并繪制蛋白灰度比值的柱形圖。?在H1299細(xì)胞外,用不同濃度乳酸對(duì)其進(jìn)行刺激，應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Snail的變化?通過RNA干擾的方法沉默糖酵

5、解關(guān)鍵酶LDHA，利用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染前后Snail的變化。?沉默轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)后，通過Western blotting檢測(cè)Snail表達(dá)沉默前后H1299細(xì)胞在乳酸作用下EMT標(biāo)志物蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1、20mM乳酸處理組較10mM組H1299細(xì)胞穿透ECM膜的細(xì)胞數(shù)量增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.016）
　　2、5,10,15,20,30mM乳酸處理

6、H1299細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)ibronectin表達(dá)上調(diào)，且各自的蛋白灰度比值與0mM對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且兩兩相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、LDHA siRNA轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后，LDHA蛋白較對(duì)照組表達(dá)水平下降，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)且兩者灰度比值差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000,0.000）。
　　4、5、10、15、20、30mM乳酸

7、處理H1299細(xì)胞后,轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)上調(diào)，且各自的蛋白灰度比值與0mM對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），且兩兩相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。用LDHA siRNA轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后，與對(duì)照組相比LDHA蛋白和Snail蛋白表達(dá)均下降且灰度比值差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000,0.000）。
　　5、10mM乳酸處理后，Snail siRNA組和NT siRNA組相比Snail蛋白表達(dá)下調(diào)且灰度比值

8、具有顯著差異性（p=0.000）;E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)且灰度比值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000）;Fibronectin蛋白表達(dá)下降且灰度比值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000）。
　　結(jié)論:
　　1、乳酸可以促進(jìn)H1299細(xì)胞的體外遷徙能力，隨著乳酸濃度增加細(xì)胞體外遷徙能力增加，二者呈正比關(guān)系。
　　2、在H1299細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外乳酸均可以誘導(dǎo)EMT上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)下降和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，說明乳酸