乙酰肝素酶對人胃癌細胞上皮間質轉化誘導的研究.pdf

1、目的:
　　研究顯示,乙酰肝素酶（HPA）能促進胃癌侵襲和轉移。但其促進胃癌侵襲、轉移的機制尚未明確。上皮一間質轉化(EMT)在腫瘤侵襲和轉移過程中起重要作用。為此,本實驗在前期研究基礎上，探討乙酰肝素酶是否通過誘導人胃癌MGC803細胞發(fā)生EMT促進胃癌細胞侵襲和轉移。
　　方法:
　　1、在無內源性表達HPA的人胃癌細胞MGC803中轉染載體pcDNA3．1(HPA)、pcDNA3．1(GFP)、pcDNA3．1(

2、+)，熒光顯微鏡下觀察轉染效率，Western Blot技術檢測轉染后，目標蛋白表達情況。
　　2、相差倒置顯微鏡觀察人胃癌細胞MGC803轉染pcDNA3．1(HPA)后的細胞形態(tài)學變化。
　　3、在激光掃描共聚焦顯微鏡下直接觀察觀察人胃癌細胞MGC803轉染pcDNA3．1(HPA)后β-catenin表達變化。
　　4、Western Blot技術檢測人胃癌細胞MGC803轉染pcDNA3．1(HPA)后細胞中上

3、皮標志物E-cadherin和間質標志物N-cadherin、Vimentin蛋白表達的變化。
　　5、細胞劃痕實驗觀察觀察人胃癌細胞MGC803轉染pcDNA3．1(HPA)后細胞遷移能力變化。
　　6、Transwell實驗觀察人胃癌細胞MGC803轉染pcDNA3．1(HPA)后細胞侵襲能力變化。
　　7、利用免疫組化方法檢測人胃癌組織中不同的病理參數間乙酰肝素酶、上皮標志物和間質標志物表達差異，觀察各病理參數下

4、的胃癌細胞上述蛋白表達情況及關系，并進行統(tǒng)計學分析，闡明它們之間的相關性，進一步驗證體外細胞水平得到結果。
　　結果:
　　1、在無內源性表達HPA的人胃癌細胞MGC803中轉染載體pcDNA3．1(HPA)、pcDNA3．1(GFP)、pcDNA3．1(+)，轉染后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，可見轉染pcDNA3．1(GFP)的細胞的轉染效率約為40％-50%，Western Blot技術檢測轉染后三組人胃癌細胞MGC803

5、以及對照組（Control）中HPA含量，轉染pcDNA3．1(HPA)的人胃癌細胞MGC803 HPA的表達高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。
　　2、倒置顯微鏡下觀察，人胃癌細胞MGC803過表達乙酰肝素酶重組蛋白后形態(tài)變梭。
　　3、通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，隨著轉染時間的推移，β-catenin發(fā)生核轉位現象，表達位置由胞膜向胞漿、胞核轉移。
　　4、Western Blot技術檢測人胃癌細胞M

6、GC803轉染前后蛋白含量變化，上皮標志物E-cadherin下降，結果具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05），間質標志物N-cadherin、Vimentin增高，結果具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。
　　5、細胞劃痕實驗證明，轉染后MGC803細胞的遷移能力增強，轉染前后相比較具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。
　　6、Transwell實驗證明，轉染后人胃癌細胞MGC803的侵襲能力增強，轉染前后相比較具有統(tǒng)計學意義（p＜0.0

7、5）。
　　7、免疫組化測定胃癌組織中蛋白量變化：低分化胃癌、中分化胃癌與高分化胃癌中HPA以及上皮標志物E-cadherin，間質標志物Vimentin、N-cadherin的表達存在差異(p＜0.05)，結果具有統(tǒng)計學意義。侵襲深度不同HPA以及上皮標志物E-cadherin，間質標志物Vimentin、N-cadherin的表達具有差異性(p＜0.05),結果具有統(tǒng)計學意義。有淋巴結轉移與無淋巴結轉移的腫瘤中HPA以及上皮標

8、志物E-cadherin，間質標志物Vimentin、N-cadherin的表達具有差異性(p＜0.05),結果具有統(tǒng)計學意義。不同位置的胃癌的HPA以及上皮標志物E-cadherin，間質細胞標志物Vimentin、N-cadherin的表達也存在差異(p＜0.05)。HPA以及上皮標志物E-cadherin，間質細胞標志物Vimentin、N-cadherin的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關（p＞0.05）。
　　結