MiCroRNA-23a對胰腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　1.研究MiCroRNA-23a在胰腺癌組織中的表達情況及其與臨床病理資料的關(guān)系。
　　2.研究MiCroRNA-23a在不同胰腺癌細胞株(Aspc-1，Bxpc-3，Cfpac-1，Panc-1)的表達規(guī)律。
　　3.研究MiCroRNA-23a體內(nèi)體外促進胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.研究MiCroRNA-23a通過靶向抑制上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1(epithelial splicingregulato

2、r protein1，ESRP1)改變CD44亞型表達，促進胰腺癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，促進胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　方法:
　　1.收集西南醫(yī)院肝膽外科2013年1月～2013年12月手術(shù)切除的胰腺癌標本及患者臨床病理資料共計47例，記錄患者FOS及OS。采用RT-PCR方法檢測MiCroRNA-23a在胰腺癌原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織以及癌旁正常胰

3、腺組織中的表達情況，比較MiCroRNA-23a在上述三種組織中的表達差異。計算癌組織中MiCroRNA-23a的相對平均表達量，并根據(jù)該值將所有標本分為MiCroRNA-23a高表達組和低表達組，分析MiCroRNA-23a表達與臨床病理資料的關(guān)系。采用Kaplan-Meier軟件進行生存分析，研究不同表達水平的MiCroRNA-23a對胰腺癌患者預后的影響。
　　2.qRT-PCR和Western blot檢測EMT標志物E-

4、鈣黏蛋白(E-cad)，N-鈣黏蛋白(N-cad)，波形蛋白(VIM)的表達，觀察細胞形態(tài)，TGF-β1誘導EMT處理，區(qū)分胰腺癌細胞系A(chǔ)spc-1，Bxpc-3，Cfpac-1，Panc-1的上皮、間質(zhì)表型。qRT-PCR檢測正常胰腺導管上皮細胞(PDC)和胰腺癌細胞(Aspc-1，Aspc-1+ TGF-β1，Bxpc-3，Bxpc-3+TGF-β1，Cfpac-1，Panc-1)miRNA-23a的表達，觀察其表達與胰腺癌細胞EM

5、T表型的關(guān)系。干擾miR-23a，觀察對TGF-β1誘導EMT的影響。
　　3.miR-23a mimic和miR-23a inhibitor分別轉(zhuǎn)染Aspc-1和Panc-1，觀察其侵襲遷移能力的變化;構(gòu)建miR-23a sponges慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染Panc-1細胞，建立穩(wěn)定細胞株，裸鼠體內(nèi)實驗觀察miR-23a促進胰腺癌轉(zhuǎn)移。
　　4.基因芯片分析和生物信息學網(wǎng)站(TargetScan.com)搜索結(jié)果交叉比較，雙

6、熒光素酶報告質(zhì)粒實驗驗證ESRP1是miR-23a的直接靶基因。
　　5.研究干擾miR-23a對ESRP1表達的影響，qRT-PCR檢測胰腺癌組織ESRP1的表達，與miR-23a的表達進行相關(guān)性分析;干擾或過表達ESRP1，觀察對胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;ESRP1回復實驗，觀察對miR-23a影響胰腺癌細胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用。
　　6.Western blot、qRT-PCR分別檢測miR-23a對ESRP1及其下游

7、CD44s/CD44v、FGFR2Ⅲb/Ⅲc剪接亞型表達的影響。ESRP1回復實驗觀察干擾miR-23a表達對下游剪接分子表達的影響。
　　結(jié)果:
　　1.胰腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中miR-23a的表達顯著高于胰腺癌原發(fā)灶和癌旁正常組織，胰腺癌MiCroRNA-23a表達與腫瘤組織分化程度、腫瘤浸潤深度（T分期）以及胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）具有顯著相關(guān)性，而其表達與年齡、性別，腫瘤發(fā)生部位及遠處轉(zhuǎn)移（M分期）等無相關(guān)性。生存分

8、析發(fā)現(xiàn)，MiCroRNA-23a表達與胰腺癌腫瘤患者預后具有相關(guān)性，高表達組預后差，生存期均低于低表達組，兩者相比較差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2.1 Aspc-1、Bxpc-3細胞呈上皮表型，Cfpac-1、Panc-1為間質(zhì)表型，TGF-β1誘導Aspc-1、Bxpc-3后，發(fā)生EMT。miR-23a在間質(zhì)表型的胰腺癌細胞中表達明顯增高。結(jié)合miR-23a在胰腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中表達增高，推測miR-23a可能促進胰腺癌細胞上皮

9、間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移。干擾miR-23a，抑制了TGF-β1誘導上皮表型胰腺癌細胞EMT的發(fā)生。
　　3.體外實驗證明，miR-23amimic轉(zhuǎn)染Aspc-1導致其侵襲遷移能力增強，miR-23ainhibitor轉(zhuǎn)染Panc-1導致其侵襲遷移能力減弱;體內(nèi)實驗證明，miR-23a sponges慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染Panc-1細胞，可以抑制miR-23a的功能，從而抑制胰腺癌細胞生長及轉(zhuǎn)移。
　　4.基因芯片分析及生物信息學

10、檢索，證實ESRP1是miR-23a的直接的下游靶基因，熒光素酶報告質(zhì)粒實驗證實ESRP1是miR-23a的直接靶基因。
　　5.ESRP1維持胰腺癌細胞的上皮表型，干擾miR-23a，ESRP1的表達發(fā)生變化;胰腺癌組織中，ESRP1的表達與miR-23a的表達呈顯著負相關(guān)。ESRP1 siRNA轉(zhuǎn)染Aspc-1后導致其侵襲遷移能力增強;ESRP1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc-1后導致其侵襲遷移能力減弱。ESRP1回復實驗，可以部分逆

11、轉(zhuǎn)干擾miR-23a表達后對胰腺癌細胞EMT的影響。
　　6.qRT-PCR、WB檢測證實miR-23a靶向抑制ESRP1的表達，從而導致下游剪接分子CD44s/CD44v、FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表達變化，ESRP1回復實驗可以部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-23a表達對下游剪接分子表達的影響。
　　結(jié)論:
　　1.MiCroRNA-23a在胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達明顯高于胰腺癌原發(fā)灶及癌旁正常胰腺組織，MiCroRNA-23a

12、表達與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度以及胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，MiCroRNA-23a表達與胰腺癌預后具有顯著相關(guān)性。
　　2.上皮表型胰腺癌細胞低表達MiCroRNA-23a，間皮表型胰腺癌細胞高表達MiCroRNA-23a，當上皮表型的胰腺癌細胞發(fā)生EMT時，MiCroRNA-23a的表達顯著增高，因此MiCroRNA-23a可能促進了胰腺癌細胞EMT。
　　3.過表達MiCroRNA-23a能夠促進胰腺癌細胞由上皮

13、表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化;抑制MiCroRNA-23a表達能夠促進胰腺癌細胞由間質(zhì)表型向上皮表型轉(zhuǎn)化。
　　4.MiCroRNA-23a能夠增強胰腺癌細胞體外培養(yǎng)細胞以及裸鼠體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　5.MiCroRNA-23a通過靶向抑制ESRP1的表達對胰腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮調(diào)控作用，從而促進胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　6.ESRP1通過調(diào)控CD44s/CD44v選擇性剪接以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc分子的表達變化影響胰腺